紫芝子实体细胞壁多糖的特征分析

颜梦秋，刘艳芳，唐庆九，吴 迪，李德顺，高 坤，杨 焱，张劲松*

（1上海海洋大学，上海201306；2上海市农业科学院食用菌研究所，农业部南方食用菌资源利用重点实验室，国家食用菌工程技术研究中心，国家食用菌加工技术研发分中心，上海201403）

紫芝（Ganodermasinense），又称黑芝、玄芝、木芝、中国灵芝，属担子菌门伞菌纲多孔菌目灵芝科灵芝属，与赤芝同为灵芝正品。紫芝在中国古代早有药用记载，具有治耳聋、利关节、保神、益精气、坚筋骨的作用。现代研究表明，紫芝中主要功能成分为多糖、三萜、生物碱等［1］。紫芝多糖是紫芝中起免疫调节和抗肿瘤作用的重要功能因子，研究表明紫芝多糖具有抗炎镇痛［2-3］、免疫调节［4-5］、抗肿瘤［6］、抗氧化［5，7-8］以及调节肠道微生物［4］等活性。

目前，对紫芝多糖的研究主要集中在多糖的提取方法优化和纯化工艺改进方面，现已从紫芝中分离获得20多个多糖组分［9］，分子量分布较为宽泛，主要为103—106级。这类多糖中的大分子量多糖（106级）主要由葡萄糖组成［9-10］；中等分子量多糖（105级）除含有葡萄糖外，还含有少量的甘露糖和半乳糖［11］；小分子量多糖（103—104级）主要由半乳糖、葡萄糖组成，还含有少量的岩藻糖、甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸［5，12-13］。这些信息为紫芝水溶性胞内多糖的开发应用奠定了基础。研究还发现，相对于赤芝子实体，紫芝子实体中提取获得水溶性多糖的得率较低［14-15］，提取剩余大量的残渣还未进行有效利用。据报道［16］，食用菌细胞壁上含有丰富的多糖成分，可以通过酸碱提取或超微粉碎处理后进一步加以利用。为了明确紫芝细胞壁多糖的特征，本研究以紫芝子实体水提残渣为研究对象，通过超微粉碎、热水浸提、分级醇沉得到紫芝细胞壁多糖样品，并对其多糖得率、单糖组成、分子量分布等特征加以描述，为进一步获得紫芝细胞壁均一多糖和开发相关功能产品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫芝子实体（菌株编号305）产于浙江龙泉灵芝栽培基地，60℃烘干至恒重，用粉碎机粉碎后备用。

单糖标品（D-果糖、D-葡萄糖胺、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、L-岩藻糖、L-鼠李糖、D-甘露糖、D-木糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸），三氟乙酸购自美国Sigma公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器

粉碎机（上海淀久公司，DJ-10A），MS105DU分析天平（美国Mettler Toledo公司）、台式离心机（美国Beckman Coulter公司）、旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）、Synergy HT多功能酶标仪（美国Bio-Tex公司）、ICS-2500型高效离子色谱仪（美国Thermo Fisher公司）、Waters 2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）、Waters 2414示差折光检测仪（美国Waters公司）、八角度激光光散射仪（美国Wyatt公司）。

1.3 紫芝子实体细胞壁多糖的提取

称取2 000 g紫芝子实体粗颗粒（直径约5 mm），以1∶10（kg/L）料液比加入蒸馏水，沸水提取2 h。取10 mL提取液离心，上清液通过苯酚-硫酸法［17］测总糖。重复以上提取步骤直至苯酚硫酸法测出的上清液不含糖时（共提取6次），停止提取。滤布过滤提取液，将提取后的残渣烘干、超微粉碎至200目（0.075 mm孔径）粉末。称取1 300 g紫芝超微粉碎末，加入蒸馏水，使料液比为1∶10，沸水浴提取2 h，滤布过滤后，将提取液在10 000g条件下离心20 min，再次以200目（0.075 mm孔径）4层滤布过滤，保留上清，离心所得的残渣与滤布过滤滤渣合并，按上述提取方法再提取2次，过滤、离心，合并3次提取上清液，真空减压浓缩至1.3 L（浓缩比1∶1）。

1.4 紫芝子实体细胞壁粗多糖的制备

在1.3 L的浓缩液中边搅拌边加入无水乙醇，使乙醇浓度达到30%（V/V，下同），4℃静置过夜，10 000g离心30 min后，分别收集沉淀和上清，沉淀用蒸馏水溶解后，90℃水浴挥干乙醇，真空冷冻干燥，命名为GSCW30E。上清进一步边搅拌边加入无水乙醇，使乙醇浓度达到50%，按照上述操作静置过夜，离心，沉淀水溶冻干后得GSCW50E。上清进一步加入无水乙醇，使乙醇浓度达到70%，按照上述操作静置过夜，离心，沉淀水溶冻干后得GSCW70E。上清液经真空减压浓缩后，90℃水浴挥干乙醇冻干后命名为GSCW70EU。得到的4个组分冻干后称重，计算多糖的提取得率。

1.5 多糖含量测定

参照左琦等［17］，使用苯酚-硫酸法测定样品中的多糖含量。

1.6 单糖组成分析

参照Zhou等［18］，采用高效阴离子色谱法，以11种单糖混合标品为对照，测定样品的单糖组成及不同单糖的摩尔分数。

1.7 多糖分子量分布测定

采用高效凝胶尺寸排阻色谱-多角度激光散射仪-示差折光检测仪（High performance size exclusion chromatography-multiple angle laser light scattering detector-refractive index detector，HPSEC-MALLS-RI）联用［19］分析多糖的分子量分布范围。根据色谱柱的检测范围，检测GSCW30E和GSCW50E的色谱柱条件为TSKgel G6000PWXL（7.8mm×30 cm）和TSKgel G4000PWXL（7.8mm×30 cm）串联联用；检测GSCW70E和GSCW70EU的色谱柱条件为TSKgel G4000PWXL（7.8 mm×30 cm）和 TSKgel G2500PWXL（7.8 mm×30 cm）串联联用，缓冲条件为0.15 mol/L NaNO3和0.05 mol/L NaH2PO4（含有0.02%叠氮钠，pH调为7.00）。

2 结果与分析

2.1 分步醇沉各组分得率和多糖含量

经过分步醇沉得到不同粗多糖组分的总得率为2.00%（表1），其中GSCW70EU的得率最高为1.00%，GSCW70E和GSCW30E的得率相近分别为0.51%和0.40%，GSCW50E的得率只有0.08%。从多糖含量上看，4个组分的多糖含量都较高，其中GSCW30E和GSCW70E的多糖含量分别高达98.99%和97.17%。

表1 分步醇沉各组分得率和多糖含量Table 1 The yield and content of crude polysaccharides fractions by stepw ise ethanol precipitation of fruiting body cell wall of Ganoderma sinense %

2.2 单糖组成分析

运用高效阴离子色谱检测分步醇沉的单糖组成及其摩尔分数，以11种单糖混合标品作标准曲线和对照。由表2可知，4个多糖组分均主要由葡萄糖组成，其摩尔分数为78.26%—94.48%，其中GSCW30E和GSCW50E中的葡萄糖占比最高，均超过90%。除葡萄糖外，各组分还含有少量的木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸以及岩藻糖和葡萄糖胺等单糖，各单糖在不同组分中的比例有所不同。

表2 分步醇沉各组分的单糖组成摩尔分数Table 2 M olar ratio ofmonosaccharide of crude polysaccharide fractions by stepw ise ethanol precipitation %

2.3 多糖的分子量分布

由表3可见，紫芝子实体胞壁多糖的分子量分布范围较广，其重均分子量范围从0.8×104—135.7×104g/mol，并呈现随着乙醇浓度的增加，所得沉淀组分分子量逐渐变小的规律。GSCW30E为大分子量组分，其重均分子量为135.7×104g/mol；GSCW50E包含两个组分（图1峰B和峰C），重均分子量分别为132.0×104g/mol和7.5×104g/mol，其中以分子量较小的峰C为主，峰B的分子量与GSCW30E的重均分子量相近，可能是30%乙醇沉淀不完全导致大分子量多糖出现在50%醇沉组分中；GSCW70E和GSCW70EU均为小分子量组分，其重均分子量分别为2.1×104g/mol和0.8×104g/mol。紫芝细胞壁多糖各组分的多分散性系数为1.2—1.9，为窄分布。

表3 分步醇沉各组分粗多糖的分子量分布特征Table 3 Molecular weight distribution of crude polysaccharide samples obtained by stepwise ethanol precipitation

图1 分步醇沉所得粗多糖的HPSEC图谱Fig.1 HPSEC spectra of crude G.sinense cellwall polysaccharide samp les obtained by stepw ise ethanol precipitation

3 结论与讨论

研究表明，真菌细胞壁主要由多糖组成［16］，多通过冷冻研磨、高压均质、酸碱提取、高温处理等方法提取［19］并进一步利用。目前对酵母细胞壁多糖的研究较多，而关于食药用菌细胞壁多糖研究较少。本研究通过对紫芝子实体水提残渣进行超微粉碎后再经水提醇沉得到细胞壁多糖组分，总得率达到2%，明显高于紫芝子实体水溶性胞内多糖的提取得率，同时细胞壁多糖各组分的多糖含量（75.33%—98.99%）也显著高于紫芝子实体水溶性胞内多糖各组分的多糖含量（27.78%—47.20%），说明紫芝细胞壁上多糖含量较丰富，获得的较高纯度的多糖也更利于后续的分离纯化。另外，单糖组成分析比较结果显示，紫芝细胞壁多糖与其水溶性胞内多糖在单糖组成特征上有所不同，细胞壁多糖除了具有与胞内多糖相同的五种单糖（岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖）外，还含有少量的葡萄糖胺和葡萄糖醛酸；且胞内多糖中以葡萄糖和半乳糖含量较高，而细胞壁多糖中以葡萄糖为主。对细胞壁多糖的结构解析将在后续工作中进行。

据报道，紫芝菌丝体和子实体多糖都有较好的增强免疫活性，可以促进巨噬细胞中细胞因子的分泌［20］，也有研究表明猴头菌细胞壁多糖具有刺激鼠巨噬细胞释放NO的作用［21］。因此，本研究过程中也考察了四种细胞壁多糖组分刺激小鼠巨噬细胞Raw 264.7分泌NO的作用，以及对分化的THP-1细胞分泌TNF-α的影响，结果显示四种组分均无明显作用，初步判断紫芝细胞壁多糖的体外活性不同于菌丝体多糖和子实体多糖［22］，其生物活性有待进一步研究。