香菇失香突变菌株的营养成分和呈味物质分析

余昌霞，赵 妍，陈明杰，杨焕玲，奚莉萍，汪 虹，查 磊

（上海市农业科学院食用菌研究所，农业部南方食用菌资源利用重点实验室，国家食用菌工程技术研究中心，国家食用菌加工技术研发中心，上海市农业遗传育种重点开放实验室，上海201403）

香菇［Lentinula edodes（Berk.）Pegler］隶属于光茸菌科（Omphalotaceae）香菇属（Lentinula），其香味浓郁、味道鲜美、营养丰富，是世界上生产规模最大的食用菌之一［1］。我国已有近千年的香菇栽培历史，据中国食用菌协会统计，2016年中国香菇年总产量已达到898.30万t。香菇‘L808’菌株因菌丝抗逆性强、适应性广，遗传特性优良、稳定，子实体菌柄短、菌肉厚、菇型大、组织致密，品质极佳，备受消费者和生产者关注和喜爱，也是我国目前主要的秋栽香菇品种之一。2015年底，我国北方香菇栽培基地的农户从主栽香菇品种‘L808’中采摘到少量几乎没有香菇香味的子实体，外观上难以与‘L808’区分，将其经过组织分离得到新菌株，命名为ww808。香菇无香味可能会影响其商品价值，进一步影响销量。

风味物质是评价食用菌品质的重要指标之一。食用菌的风味包括香味和滋味［2-3］，香味主要依赖于挥发性风味成分，通过人的嗅觉系统感受；滋味则取决于其含有的非挥发性呈味物质的种类及含量，通过人的味觉系统感受［4-6］。食用菌独特的滋味，主要是因为含有一些如游离氨基酸、5’-核苷酸、可溶性糖（醇）、有机酸等小分子物质发挥其风味作用，表现出鲜、甜等滋味。基于此，可利用氨基酸自动分析仪、离子色谱仪、高效液相色谱仪等仪器分别对香菇子实体的非挥发性呈味物质［游离氨基酸、可溶性糖（醇）、有机酸及5’-核苷酸］的组成及含量进行测定，并计算等鲜浓度值（EUC），对香菇菌株子实体的鲜味进行分析和评价。笔者曾采用固相微萃取气质联用技术对香菇菌株‘L808’与突变菌株ww808的挥发性风味物质进行了分析，发现‘L808’和ww808菌株菌丝体中挥发性成分主要是醛类化合物、芳香和烯烃化合物，其次是含硫化合物。ww808菌株的前两类成分含量较高，但含硫化合物仅为‘L808’菌株的9.16%；两菌株子实体中挥发性成分主要是含硫化合物，其中ww808菌株的含硫化合物含量是‘L808’的64.61%［7］。在此基础上，本研究拟进一步对两个香菇菌株子实体的滋味进行分析，以期阐明香菇‘L808’菌株与其突变菌株ww808的风味差异，分析源自‘L808’的突变菌株ww808究竟有哪些代谢产物发生了改变。

1 材料与方法

1.1 供试菌株与培养基质

香菇菌株‘L808’保藏于上海市农业科学院食用菌研究所，ww808菌株（‘L808’突变菌株，几乎无香菇香味）受赠于中国农业科学院农业资源与农业区划研究所张金霞研究员。

菌丝培养采用PDA培养基，栽培试验的配方为78%木屑、20%麸皮、2%石膏粉，含水量60%。

1.2 主要仪器与试剂

中药粉碎机（DJ-10A型），上海淀久中药机械制造有限公司；鼓风干燥箱（DHG-9240A型），上海一恒科学仪器有限公司；凯氏定氮仪（VELP UDK169型），意大利VELP公司；高效液相色谱仪（HPLC，Waters 2695型），美国沃特世公司；Ultimate AQ-C18液相色谱柱，月旭科技（上海）股份有限公司；离子色谱仪（Dionex ICS-2500型）、脉冲安培检测器、阴离子交换柱CarboPac MA1，美国戴安公司；氨基酸自动分析仪（Hitachi L-8900型），日本日立公司。

氨基酸标准品，阿拉伯糖醇、甘露醇、甘露糖、海藻糖、葡萄糖、赤藓糖醇、果糖、半乳糖和岩藻糖等9种可溶性糖及糖醇标准品，延胡索酸、苹果酸、乙酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸和抗坏血酸等7种有机酸标准品，5’-AMP（5’-腺苷酸）、5’-CMP（5’-胞苷酸）、5’-GMP（5’-鸟苷酸）、5’-IMP（5’-肌苷酸）、5’-UMP（5’-尿苷酸）、5’-XMP（5’-黄苷酸）等单核苷酸标准品，均为美国Sigma公司产品。其他试剂均为分析纯。

1.3 样品处理

香菇栽培时间为2016年11月中旬，采收第一潮菇作为样本，将采收的子实体放于50°C烘箱内烘干24—48 h，使其含水量低于10%，迅速用粉碎机粉碎，过60目（250μm孔径）筛后置于干燥器中备用。

1.4 粗蛋白测定

按照GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》食品安全国家标准凯氏定氮法测定粗蛋白含量［8］。

1.5 水解氨基酸测定及评价

参照张璐等［9］的方法进行水解氨基酸的提取，采用氨基酸自动分析仪测定各种氨基酸的含量［10-11］，每个样品做3次平行试验。氨基酸评分（Amino acid score，AAS）计算参照WHO/FAO的方法［12］，化学评分（Chemical score，CS）计算参照FAO和Seligson等［13］推荐的方法，必需氨基酸指数（Essential amino acid index，EAAI）评价参照 Oser等［14-15］的方法，氨基酸比值系数（Ratio coefficient of amino acid，RC）以及氨基酸比值系数分（Score of RC，SRC）参照朱圣陶等［16］的方法计算。

1.6 可溶性糖（醇）测定

样品提取参照薛俊杰等［17］的方法进行，采用ICS-2500型离子色谱仪参照周帅等［18］构建的高效阴离子色谱法检测可溶性糖（醇）含量，每样品做3次平行试验。

1.7 有机酸测定

参照谷镇等［19］的方法提取有机酸，采用Waters 2695型高效液相色谱仪参照陈万超等的方法［20］检测有机酸含量，每样品做3次平行试验。

1.8 游离氨基酸测定

参考Tseng等［21］和Tsai等［22］的方法并适当改进对游离氨基酸进行提取，采用L-8900型氨基酸自动分析仪测定游离氨基酸含量，每样品做3次平行试验。

1.9 呈味核苷酸测定

参照Taylor等［23］的方法提取核苷酸，采用Waters 2695型高效液相色谱仪参照文献［24-25］测定核苷酸含量，每处理做3次平行试验。

1.10 等鲜浓度值（Equivalent um am i concentration，EUC）计算

鲜味氨基酸与呈味核苷酸的协同作用所产生的鲜味强度，既可以显著提高鲜味效果，也具有协同和增鲜效果。等鲜浓度值的计算公式［26］为：Y＝∑ai bi＋1 218（∑ai bi）（∑aj bj），式中：Y为等鲜浓度［g MSG/（100 g）］；ai为鲜味氨基酸（谷氨酸或天冬氨酸）含量［g/（100 g）］；aj为呈鲜核苷酸（5’-GMP、5’-IMP、5’-XMP、5’-AMP）含量［g/（100 g）］；bi为鲜味氨基酸相对谷氨酸比值（谷氨酸 ＝1、天冬氨酸 ＝0.077）；bj为呈鲜核苷酸相对 5’-肌苷酸比值（5’-GMP＝2.3、5’-IMP＝1、5’-XMP＝0.61、5’-AMP＝0.18）；1 218为协同作用常数。

1.11 数据分析

数据处理与分析采用SPSS 19.0软件。

2 结果与分析

2.1 蛋白质营养评价

2个香菇菌株‘L808’和ww808子实体中的粗蛋白含量分别为（23.29±0.04）g/（100 g）和（27.21±0.28）g/（100 g），ww808菌株的粗蛋白含量约为‘L808’菌株的1.17倍。2个香菇菌株均含有17种常见氨基酸（色氨酸未检测），ww808菌株的水解氨基酸总量及必需氨基酸总量均高于‘L808’菌株（表1），分别为‘L808’菌株的1.22和1.13倍。‘L808’和ww808菌株的必需氨基酸（EAA）与总氨基酸（TAA）比值E/T分别为0.34和0.31，必需氨基酸（EAA）与非必需氨基酸（NEAA）的比值E/N分别为0.52和0.46。FAO/WHO提出的理想蛋白模式为E/T达到0.4和E/N在0.6以上［9-10］，表明2个香菇菌株中的氨基酸均接近FAO/WHO提出的理想蛋白模式，属于质量较好的蛋白质。

表1 2个香菇菌株水解氨基酸含量Table 1 Hydrolytic am ino acids content of Lentinula edodes strains‘L808’and ww808 g·（100 g）-1干重

如表2所示，‘L808’和ww808菌株的必需氨基酸总含量分别为412.94 mg/g pro和393.99 mg/g pro，均明显优于WHO/FAO模式（350 mg/g pro），但低于鸡蛋模式（497 mg/g pro），且‘L808’菌株蛋白质量优于ww808菌株。从单个氨基酸来看，‘L808’菌株除Met＋Cys之外，其他必需氨基酸含量均高于WHO/FAO模式值，而ww808菌株除Lys和Leu外，其他氨基酸含量也均高于WHO/FAO模式值。基于AAS计算的‘L808’和ww808菌株的第一限制氨基酸分别是Met＋Cys和Lys，除此之外，其他必需氨基酸含量均高于标准模式蛋白。根据CS计算的‘L808’和ww808菌株的第一限制氨基酸分别是Met＋Cys和Ile，‘L808’菌株中除Met＋Cys化学评分低于ww808菌株外，其他氨基酸化学评分均高于ww808菌株，比ww808菌株更接近鸡蛋蛋白。氨基酸平衡性分析表明，‘L808’和ww808菌株的氨基酸比值系数分别为0.89—1.18和0.88—1.19，‘L808’菌株的Thr和Met＋Cys以及ww808菌株的Met＋Cys和Lys分别正负向偏离平衡谱最远，经计算两个香菇菌株的氨基酸比值系数分SRC分别为88.98和87.69，均高于部分粮食作物小麦（72.47）、大米（70.50）以及卵清蛋白（81.22）。‘L808’和ww808菌株的EAAI分别为78.57和76.19，说明‘L808’菌株蛋白中必需氨基酸均衡性、相互之间比例均优于ww808菌株。

表2 2个香菇菌株蛋白的必需氨基酸营养特征分析Table 2 Essential am ino acid nutritional characteristics analysis of protein of Lentinula edodes strains‘L808’and ww808

2.2 呈味物质分析与鲜味评价

2.2.1 可溶性糖（醇）含量

2个香菇菌株中主要检测到3种糖（醇），其他种类的糖（醇）含量相对太低，可忽略不计。如表3所示，含量最高的是甘露醇，其次是阿拉伯糖醇，海藻糖含量最低。‘L808’菌株的可溶性糖（醇）总量较ww808菌株高，且阿拉伯糖醇和海藻糖含量均高于ww808菌株，甘露醇含量在2个菌株中差异不大。

表3 2个香菇菌株的可溶性糖（醇）含量Table 3 Soluble sugar（alcohol）content of Lentinula edodes‘L808’and ww808 mg·g-1

2.2.2 有机酸含量

如表4所示，2个香菇菌株中共检测到5种有机酸，其中琥珀酸含量最高，其次是苹果酸。‘L808’和ww808菌株的有机酸种类相同，但无论是单个有机酸含量还是有机酸总量，ww808菌株均高于‘L808’菌株。其中，ww808菌株的有机酸总量、琥珀酸、苹果酸含量分别是‘L808’菌株的2.49倍、3.07倍和2.18倍。

表4 2个香菇菌株的有机酸含量Table 4 Organic acids content of Lentinula edodes strains‘L808’and ww808 mg·g-1

2.2.3 游离氨基酸差异分析

如表5所示，‘L808’菌株的游离氨基酸含量稍低于ww808菌株。2个香菇菌株中谷氨酸含量均为最高，它是主要的呈鲜氨基酸种类，‘L808’和ww808菌株的谷氨酸含量分别占鲜味氨基酸总量的94.51%和89.02%。‘L808’菌株鲜味氨基酸含量略高于ww808菌株，2个香菇菌株中鲜味氨基酸含量均处于低水平（鲜味氨基酸含量＜5 mg/g）［27］。‘L808’和ww808菌株的甜味氨基酸在3种滋味氨基酸中含量最高，其中丙氨酸含量仅次于谷氨酸，也是主要的甜味氨基酸，其与鲜味物质相互作用可达到提鲜的效果。

表5 2个香菇菌株的游离氨基酸含量Table 5 Free am ino acids content of Lentinula edodes strains‘L808’and ww808 mg·g-1干重

2.2.4 5’-核苷酸分析及鲜味评价

2个香菇菌株中均检测出5种单核苷酸，未检测到5’-XMP，‘L808’菌株的单核苷酸、鲜味核苷酸及总核苷酸含量均低于ww808菌株（表6）。其中，5’-胞苷酸含量最高，在2个香菇菌株中相差也最大。2个香菇菌株中鲜味核苷酸含量均处于低水平（鲜味核苷酸含量＜1 mg/g）［27］。

表6 2个香菇菌株5’-核苷酸含量及EUC评价Table 6 The content of 5’-nucleotides and EUC value of Lentinula edodes strains‘L808’and ww808 mg·g-1

鲜味氨基酸和呈鲜核苷酸具有协同增鲜作用，等鲜浓度值（EUC）从量化上衡量了它们之间的协同作用。经计算，‘L808’和 ww808菌株的 EUC值分别为 38.70 g MSG/（100 g）和 53.38 g MSG/（100 g），‘L808’菌株的鲜味不及ww808菌株，其EUC值约为ww808菌株的72.49%。2个香菇菌株鲜味均处于第3水平［10—100 g MSG/（100 g）］［28-29］。

3 结论与讨论

本研究对北方香菇栽培基地主栽品种‘L808’菌株及其突变菌株ww808蛋白质营养和呈味物质进行了研究与分析。‘L808’菌株的第一限制氨基酸是Met＋Cys，这与杨琴等［30］研究结果一致。ww808菌株子实体蛋白中Met＋Cys的AAS值和CS值高于‘L808’菌株，Met和Cys均是含硫氨基酸，表明ww808菌株子实体的含硫氨基酸较‘L808’菌株更丰富。其中蛋氨酸是必需氨基酸，在体内可转化成半胱氨酸或胱氨酸，但此反应不可逆转。含硫氨基酸不仅是食品中硫的主要供体，如为体内辅酶A和牛磺酸等含硫化合物提供硫原子，而且可以抑制食品褐变及美拉德反应，从而防止食品风味受到影响和营养价值降低。含硫化合物是食品风味的一大主体，含硫氨基酸及其衍生物是大多数含硫风味化合物的直接或间接前体物质，蛋氨酸加热可分解为有清香气味的二甲硫醚，半胱氨酸受热可降解产生氨、硫化氢和乙醛，它们都影响着食品产生香气。从笔者对两菌株挥发性风味成分分析结果可知，ww808菌株的含硫化合物在菌丝体阶段仅为‘L808’菌株的9.16%，而到子实体阶段其含量是‘L808’菌株的64.61%［7］，其原因是否与ww808菌株子实体的含硫氨基酸含量较丰富有关有待进一步的验证。除Met＋Cys之外，‘L808’菌株子实体蛋白中其他必需氨基酸的AAS值、CS值及EAAI值均远高于ww808菌株。综合可知，‘L808’菌株子实体蛋白质营养较ww808菌株更均衡、相互之间的比例更优。

本试验表明，两菌株子实体中呈味物质的种类相同，因此其滋味差异主要体现在呈味物质的含量及强度上。可溶性糖（醇）是食用菌产生甜味的主要物质，其种类以及含量直接影响食用菌的滋味与口感。甘露醇是一类新型的低能量甜味剂，能够预防龋齿，适合糖尿病患者、肥胖者使用；阿拉伯糖醇是生产木糖醇的重要中间体；海藻糖甜度较低，近年来常被应用于食品中。‘L808’菌株子实体的阿拉伯糖醇、海藻糖等可溶性糖（醇）含量比ww808菌株更高，因此‘L808’菌株子实体甜味强度更大。ww808菌株子实体中检测到的有机酸含量均较‘L808’菌株高，特别是琥珀酸含量相差较大，琥珀酸及其钠盐具有较好的呈鲜效果，被广泛应用于呈鲜剂；苹果酸具有提神的酸度和微苦味。两菌株中乙酸、柠檬酸和延胡索酸含量较低，其中乙酸味道较刺激，柠檬酸具有清新的酸味，延胡索酸具有水果味，可作为饮料等的酸味剂，这些有机酸均在一定程度上影响着它们的呈味。氨基酸在人体新陈代谢中起着重要的作用，其呈味特性主要是鲜味、甜味、苦味和无味。Chen等［31］研究表明，呈苦味的氨基酸不具有味觉活性，高含量的可溶性糖（醇）产生的甜味可能将苦味成分遮掩；KOMATA等［32］研究表明，鲜、甜味氨基酸是香菇子实体中的主要氨基酸。本试验表明，ww808菌株子实体中游离氨基酸及呈味核苷酸含量均较‘L808’丰富。‘L808’菌株和 ww808菌株的 EUC值分别为38.70 g MSG/（100 g）和53.38 g MSG/（100 g），‘L808’菌株的 EUC仅为ww808菌株的72.49%，表明ww808菌株中两类呈鲜成分协同作用更明显，ww808菌株鲜味呈鲜效果较‘L808’菌株更突出。综上并结合两菌株挥发性成分分析，与突变菌株ww808菌株相比，‘L808’菌株的香味更浓郁、蛋白质营养更丰富，而ww808菌株滋味更鲜美、EUC值更突出。ww808菌株的香味虽不及‘L808’菌株浓郁，但其滋味更强，仍有一定的商业价值，如将其加工制作成调味品。基于对香菇浓郁的香味敏感而不食或少食的人群，本试验可为清香/无香型香菇育种方向提供理论支持，也可为进一步研究香菇风味形成机理提供参考。