仙客来新品种特异性、一致性和稳定性测试指南的研制

邓 姗，褚云霞，3*，林 艳，郭伟珍，杨旭红，李寿国，陈海荣，3**

（1上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，上海201403；2农业农村部植物新品种测试（上海）分中心，上海201415；3上海市设施园艺技术重点实验室，上海201403；4河北省林业科学研究院，石家庄050061；5农业部科技发展中心，北京100122）

仙客来（Cyclamen persicumMill.）为报春花科仙客来属多年生球根草本花卉，其叶片心形或近心形，造型可爱；花色丰富，有白色，紫色，红色及复色等，花瓣上有复轮、爪、眼睛状斑块等图案，极具观赏性；仙客来花期长，开花时间为11月至翌年5月，恰逢圣诞、元旦、春节等重大节日，深受广大消费者的喜爱［1］。

18世纪中叶，英、法、德的园艺家开始了仙客来新品种的培育，20世纪仙客来已发展成国际性的重要盆花。日本、荷兰、瑞典、美国、以色列和澳大利亚纷纷开展仙客来的育种。至今已培育出数千个园艺品种，并推广到世界各地［2］。尽管仙客来品种众多，但除保护所有种属的国家外，仅中国和比利时将仙客来纳入了保护名录，除欧盟外，仅日本和韩国有申请量，申请量也较少，仅授权105件，因此国际植物新品种保护联盟（UPOV）尚未开展国际DUS测试指南的研制。

中国没有仙客来野生资源的天然分布，20世纪20—30年代开始引入仙客来进行栽培［3］，目前市场上的主要栽培品种均为国外引进的仙客来 F1代杂交种［4］，主要来自莫莱尔公司（The Morel Diffusion company）、荷兰先正达种子有限公司（Syngenta Seeds BV）、荷兰斯好莱花卉公司（Schoneveld Breeding）、艾罗仙客来育种公司（Eyraud Plants）几大国际知名育种公司。随着育种和栽培技术的不断提高和完善，仙客来的发展取得了长足进步，早在20世纪70年代末，天津仙客来盆花在全国就有了一定知名度，现已建立160多个品种的仙客来种质基地［5］。近年来，我国仙客来的生产和销售更是呈快速增长趋势［5］，在各大省市的销售排名均在前十位。目前在山东、河北、辽宁、四川、山西、云南、内蒙古、上海、北京等地均建立了仙客来生产基地，2018年仙客来每盆售价在60元（人民币，下同）到150元不等，每年都有一定数量仙客来盆花出口日本。我国仙客来育种工作也取得了一定成绩，如天津市园林绿化研究所通过自交和杂交的方法推出七大系列40多个类型的仙客来新型材料［6］、山西省农业科学院园艺研究所的银叶系列新品种［7］、山东莱州育成的新潮系列、长袍系列和大酒瓶系列、莱州大红等［8］。同时在突变育种［9］、单倍体育种［10］方面也进行了一定的研究。

DUS（特异性、一致性和稳定性）是品种的基本属性，植物品种具备DUS三性是获得植物品种权的必要条件［11］。为了规范市场，保护育种者权利，促进更多更好国外品种引入我国市场及我国新优品种走出国门，进入国际市场，均需实行新品种保护。具有相应种（属）的测试指南是开展DUS测试的必备条件之一。本研究阐述仙客来DUS测试指南研制的主要过程和制订的主要方式，列出所有数量性状的分级标准，以期较好地指导仙客来DUS测试实践。

1 研制的目标和过程

1.1 研制目标

仙客来DUS测试指南的研制以《中华人民共和国植物新品种保护条例》为准则，以《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则》（GB/T 19557.1—2004）［12］、《植物新品种特异性、一致性和稳定性审查和性状统一描述总则》［13］和《植物新品种测试指南的研制》（UPOV TGP/7/4）［14］等文件为指导，结合我国仙客来育种和生产的现状，研制出符合我国国情的仙客来DUS测试指南。

1.2 研制过程

1.2.1 参考资料的收集

收集日本测试指南以及与仙客来相关的育种、资源等20余篇文献以及《中国植物志》等资料。

1.2.2 仙客来资源收集与栽培

共收集28份仙客来品种，种植于农业部植物新品种测试（上海）分中心玻璃温室中，按植物大小不同分别种植于12—15 cm花盆，以泥炭∶珍珠岩（3∶1）混合为栽培基质，单株盆栽。

1.2.3 仙客来DUS测试指南研制的主要内容的确定

（1）依据相关资料对仙客来的抗病性，抗逆性等特性进行预判；

（2）依据《中国植物志》及日本的测试指南，初步确定候选性状；

（3）通过田间试验，筛选性状，对数量性状进行分级，并依据此数据确定标准品种；

（4）结合田间试验和室内分析试验，研究仙客来DUS三性的测试方法，包括样本数量、测试时期、测试部位以及观察方法；

（5）确定分组性状，编写技术问卷。

2 仙客来DUS测试指南的制订

按照农业部科技发展中心撰写的《植物品种特异性、一致性和稳定性测试指南编写规则》，仙客来DUS测试指南由10个章节和3个规范性附录组成（表1）。

表1 仙客来新品种DUS测试指南的结构Table 1 The structure of guidelines for the conduct of tests for distinctness，uniform ity and stability：Cyclamen

2.1 适用对象的确定

仙客来属（Cyclamen）约20个种［15］。其中仙客来（C.persicum）是本属最著名、栽培最广泛的植物，于20世纪30年代就引入我国栽培。现在的仙客来品种大部分是从原种仙客来经过多年培育改良而来，该原种有两个变种，即大花形变种（var.giganteumHort）和暗红色变种（var.spendensHort）［16］。国际上申请品种权也主要集中在地中海仙客来（C.hederifoliumAiton）、仙客来（C.persicumMill.）、仙客来与欧洲仙客来杂交种（C.persicumMill.×C.purpurascensMill.）、欧洲仙客来（C.purpurascensMill.）。已有的形态学［17］、细胞学［18］、分子生物学［19］研究均表明，三种仙客来的亲缘关系较远，特别是仙客来与其他两种均有显著差别。其中欧洲仙客来和地中海仙客来染色体数目均为34，花期夏秋季，而仙客来为48，花期冬春季。三种仙客来形态上有较大差别，如地中海仙客来根从块茎的上部和侧边长出，叶心形到箭形，由于具较强耐寒性，多用于庭院种植；欧洲仙客来根从块茎的侧边和底部长出，叶肾形到心形，冬季不落叶，花香；而仙客来一般从底部长出，叶心形到近圆形。由于目前我国市场上收集到品种均为仙客来，因此规定本指南仅适用于仙客来（C.persicumMill.）新品种特异性、一致性和稳定性测试和结果判定，仙客来属的其他种可参考。

2.2 测试性状的选择与确定

日本仙客来测试指南包括了42个性状，其中41个形态性状，1个物候期性状，有些性状极为繁琐，如花瓣颜色需分先端、中部、基部分别进行比色，有些性状难以观测，例如花茎结实后的螺旋程度等。因此结合国内科研、生产等实际情况，以及多年来田间观测，最终确定了该标准中的40个性状（表2）。

表2 仙客来DUS测试指南性状Table 2 The characteristics in DUS test guidelines of C.persicum

（续表2）

注：QN：数量性状 QL：质量性状 PQ：假质量性状VG：群体目测 MS：个体测量；灰色是特别提示测试性状的适用范围

仙客来的叶和花均具有较高的观赏性，因此大部分性状集中在叶和花上，分别为15个和23个。按照性状的表达类型进行分类，质量性状8个，数量性状20个，假质量性状12个（表3）。

表3 仙客来DUS测试指南选用的性状分类Table 3 The type of characteristics in DUS test guidelines of C.persicum 个

日本测试指南适用范围为仙客来属［20］，其中较多性状由于在其他种上表现出多态性，并不适合仙客来，因此我国指南删除了15个性状，增加了13个性状（表4）。删除的性状中，“花瓣：边缘缺刻数量”和“花瓣：边缘缺刻程度”在实际的观察中难于区分，增加了测试误差，因此中国指南中在保留了“花瓣：边缘缺刻”的性状的同时，将表达状态调整为无、弱、强三种；仙客来的花瓣次色不仅分布在边缘及先端，也可能分布在纵向分布，而仅分别观测花瓣先端、中部和基部颜色，不能区分主色和次色，无法对花瓣颜色进行准确描述，因此改为分别观测花瓣的主色与次色，并观测次色的类型和位置分布；日本指南中开花习性有春季开花、秋季开花、四季开花三种表达状态，而仙客来花期受温度、水分、光照以及施肥的因素影响较大且可长达6个月，另外由于仙客来属于日照中性植物，日照长度的变化对花芽分化和开花没有决定性的作用［21］。其花期主要受生长状态影响，一般播种后12—15个月开花，因此删除了该性状。

表4 仙客来DUS测试指南中日版对比Table 4 Difference between DUS test guidelines of China and Japan

在收集到的品种中未观测到花萼瓣化现象，反而有雄蕊发生瓣化（图1），而雄蕊瓣化到一定程度后可能成为重瓣品种，因此，在未计数花瓣数的情况下，有必要观测雄蕊的瓣化情况。

图1 花：雄蕊的瓣化Fig.1 Flower：petalody of stamen

一般情况下仙客来的萼片数为5片，观测中发现有数量增减情况，大多数情况下，萼片数与花瓣数相同，如4花瓣和4萼片，6花瓣和6萼片，也有可能不同，如同样为6萼片，则存在5花瓣和7花瓣的情况，由于这种变异在品种中并不完全一致，因此仅观测萼片是否出现变异，而并不计数萼片的数目（图2）。

图2 花：萼片变异Fig.2 Flower：variation of sepal number

花药颜色有黄色、褐色和紫红色，块茎颜色分别为浅褐色、灰褐色和红褐色，这两个性状观测方便，受环境影响小，满足DUS测试性状的其他要求，因此增加为测试性状。

对于仙客来来说，花是重要的观赏部位，花茎的数量是评价仙客来盆花商品价值的重要指标，而且随着仙客来作为切花应用，花茎数量多必将成为育种的主要目标。尽管花叶的数量具有明显的相关性，但Neuray［22］认为茎的表面可以直接形成不定芽，不定芽可以分化叶芽和花芽，因此，花叶的数量并不呈现一对一的相关性。因此，有必要增加花茎：数量作为测试性状。

2.3 数量性状分级

依据《植物新品种特异性、一致性及稳定性测试及统一描述总则》（TG/1/3）的说明，参照朱顶红新品种DUS测试数量性状的分级方法［23］，结合田间试验，对仙客来的9个需进行个体测量的数量性状进行分析，9个数量性状的最小值、最大值、平均数、标准差和变异系数等值见表5。可以看出，这些品种的平均变异系数分布在8.3%—17.7%，除叶片数量和叶柄长度外，其他性状的变异系数均小于15%，表明这些性状在品种内表达满足一致性要求。按照级差大于等于2倍平均标准差的要求，将9个性状进行分级（表6）。

表5 仙客来DUS测试数量性状Table 5 The data of quantitative characteristics used for DUS testing of C.persicum

表6 仙客来DUS测试数量性状的分级Table 6 The scales of quantitative characteristics used for DUS testing of C.persicum

2.4 标准品种的选用

在植物新品种测试中，用于性状示例、校准环境对性状的影响的品种，称为标准品种。标准品种的选用原则是容易获得且性状表达稳定，尽可能用最少量的标准品种涵盖所有性状及其表达状态［24］。本指南中采用了大量的图片及图例进行性状解释，而仅选用了4个标准品种：日本模瓣粉、艾罗红皱边、清芬大花红、荷兰小花白，分别使用了15次、6次、31次和13次，为9个数量性状的年度间及地点间的校准提供依据，大大减少了测试工作量、降低了测试成本。

2.5 分组性状的选用

按照TGP/7/2的说明，分组性状必须是质量性状或者在不同地点的表达状态能够明显区分已知品种的数量性状或假质量性状；能够排除已知品种或者在进行DUS测试时能够安排近似品种相邻种植［25］。分组性状的数量不是固定的，如果只有少数性状满足以上的标准，则它们可能全部被选为分组性状；如果满足上述条件的性状较多，则选择部分为分组性状。

依据上述标准，仙客来测试指南选用了6个分组性状，分别是（1）植株：大小（性状1）；（2）花茎：数量（性状 16）；（3）花瓣：边缘波状程度（性状 25）；（4）花瓣：长度（性状 26）；（5）花瓣：主色（性状 30）；（6）花：雄蕊的瓣化（性状35）。

2.6 仙客来DUS判定标准

2.6.1 特异性判定

特异性是如果一个品种明显区别于申请时其他任何已知品种，则认为该品种具有特异性。在测试中，当申请品种至少在一个性状上与近似品种具有明显且可重现的差异时，即可判定申请品种具备特异性。

2.6.2 一致性判定

如果一个品种“考虑到其有性繁殖或无性繁殖表现出足够的同质性”，则认为其具备一致性。

种子繁殖是仙客来的主要繁殖方式，而杂交育种是仙客来的主要育种方式，因此在DUS测试中，一致性判定时，允许相对较多的异型株，采用了2%的群体标准和至少95%的接受概率。当样本大小为19—41株时，最多可以允许有2个异型株，当样本大小为42—60株时，最多可以允许有3个异型株。而叶片斑纹由于受光照、营养等因素影响较大，在一致性判定时，品种的变异程度不能显著超过同类型品种。

2.6.3 稳定性判定

如果一个品种经过重复繁殖后，或在每个特定的繁殖周期结束时，如果其相关性状仍保持不变，则应认为其具备稳定性。一般情况下，不对稳定性做测试，当递交的材料具有一致性，则认为具有稳定性。必要时，可以种植该品种的下一批种子，与以前提供的种子相比，若性状表达无明显变化，则可判定该品种具备稳定性。对于杂交种的稳定性判定，还可以通过测试其亲本的一致性和稳定性来进行判定。

3 结论与讨论

我国仙客来DUS测试指南在调查市场上主栽品种的基础上，充分考虑我国的育种现状，选择了40个表达稳定、多态性好且易于观察的性状作为DUS测试性状。其中20个QN性状仅有8个性状需个体测量，在减少测试工作量的同时保证了性状的区分能力。仙客来品种分类至今没有统一的标准，多以花型分类，分为皇冠型、平瓣型、洛可可型、大花型四种［26］。分组性状综合考虑了生产上常用的分组方式，依据花瓣长度可以先将大花型品种、皇冠型品种与平瓣型和洛可可型分成两组，再根据花瓣：边缘波状程度将大花型品种与皇冠型品种区别开。同时通过植株：大小区分巨型品种、中型品种及微型品种。

对于数量性状，根据品种内的变异程度、品种间差异程度、育种水平、品种的繁殖方式等不同可采用目测或测量的方式。个体测量可以取得较多的信息，在一致性和特异性分析时不仅可以采用代码法，还能用统计分析方法，但同时也将耗费较多的时间采集数据。有些数量性状如“花茎：粗度”，经分析其品种内变异系数仅8.3%，且只分3级，级差较大，在测试任务量大的情况下，可以考虑采用群体测量或群体目测的方式，以提高测试效率。

尽管在仙客来品种内存在个别花朵萼片与花瓣数不为5的情况，但在“花：花瓣数”的观测时，以占多数的花瓣数为整个品种该性状的表达状态，因此所有收集到的品种都只有一种表达状态，该性状不能区分品种的特异性，不满足作为DUS测试的要求，因此删除了这个性状。而许多文献（如《中国植物志》［27］）均表示仙客来有重瓣品种，且有报道日本已成功育成了重瓣系仙客来。虽然在我国市场上还未见到重瓣品种，但是随着育种的进程，未来有可能出现半重瓣和重瓣品种，为了提高指南的适用性，当该类型品种大量出现时，应对指南进行修改，增加“花：类型”或“花：花瓣数”为测试性状。

我国仙客来DUS测试指南的研制过程中参考了日本仙客来属DUS测试指南，删除了在仙客来品种中缺乏多态性的性状，同时增加了利于区分品种的性状，提高了我国指南的适用性和可操作性。但是，早在2009年河北省林业科学研究院为培育适合我国栽培的地中海仙客来，就从国际仙客来协会荷兰分会先后引进多种不同类型的地中海仙客来［4］。另外欧洲仙客来等大量的不为人们所熟知的种在欧洲市场上都早已被利用起来［28］，我国仙客来DUS测试指南是否能适用于仙客来属其他种，或者经过修订后能否扩大适用范围至仙客来属，还需收集其他原生种进行观测验证。