甲状腺功能紊乱对雌性小鼠血糖的短期影响

汪 洋，余 婷，陈可洋

甲状腺功能紊乱(thyroid dysfunction, TD)，即甲状腺功能亢进和甲状腺功能减退，女性比男性患病率高。女性青春期必需营养物质碘的需求增加，甲状腺激素对生长发育有重要意义。甲状腺激素在青春期生殖系统的适当发育和功能中发挥重要作用[1]。甲状腺激素对生长也存在不可忽视的作用。目前研究[2]提示青春期甲状腺激素水平与骨质发育有关联，青春期甲状腺功能亢进患者可严重影响青少年的骨代谢，导致骨转换加速，骨密度降低。

甲状腺激素在葡萄糖代谢中起重要作用。正常机体胰岛素分泌通过葡萄糖感受器调节，甲状腺激素分泌同时影响胰岛素[3]。三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine, T3)是生物活性激素，80%循环T3是活化的脱碘酶和单体碘化的四碘甲状腺原氨酸(thyroxine, T4)在外周转化而来，它主要负责葡萄糖代谢活动[4]。

1 材料与方法

1.1 试剂与实验动物3周龄C57BL/6J雌性小鼠(9～12 g)30只，从北京维通利华(Vital River)公司购买。游离三碘甲状腺原氨酸(free triiodothyronine, FT3)、游离四碘甲状腺原氨酸(free thyroxine , FT4)试剂盒购于武汉伊莱瑞特生物科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒、RIPA裂解液购自江苏碧云天生物技术有限公司；葡萄糖-6-磷酸激酶(glucose-6-phosphatase, G6Pase)购自美国Thermo Scientific公司，磷酸烯醇式丙酮酸激酶(phosphoenol- pyruvate carboxykinase, PPEPCK)购自美国cell signling technology公司；蛋白质印迹试验二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

试验前动物自由进食标准饲料，维持12 h光照和12 h黑暗的昼夜节律。实验室温度：20～25 ℃，湿度：(50±5)%。在上述环境适应1周后，将小鼠随机分成3组：N组(正常对照组)10只、Pe组(甲状腺功能亢进组)10只、Po组(甲状腺功能减退组)10只。

左旋甲状腺素配置成溶液，按1.2 mg/kg灌胃处理小鼠28 d造甲状腺功能亢进模型；丙基硫氧嘧啶配置成溶液，按20 mg/kg灌胃处理小鼠28 d造甲状腺功能减退模型。同时普通对照组动物灌胃等量生理盐水。实验期间动物自由进食、饮水，适应性喂养1周后每周测血糖水平及体质量至8周取材。

本实验严格遵循“NIH实验用动物管理和使用指南”，尽量减少实验动物痛苦和减少实验动物数量，禁止虐待动物。8周后，将从雌性小鼠获得的全血在3 000 r/min、4 ℃下离心20 min以收集血清。获得的肝脏立即放入液氮中冷冻，并储存在-80 ℃待提取组织蛋白备用。

1.2 生化指标检测以及蛋白质印迹实验甲状腺功能亢进、甲状腺功能减退小鼠在造模28 d后每组取3 只，使用ELISA试剂盒分析血清FT3、FT4确保造模成功，同时N组取3只小鼠测相同指标作对照。蛋白质印迹试验检测肝脏组织中G6Pase、PEPCK的表达水平。

通过蛋白质印迹试验测定靶蛋白的表达水平。用含有完全蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液制备肝匀浆。将裂解物在12 000 r/min、4 ℃下离心15 min。通过BCA测定法定量上清液提取物的蛋白质浓度。将蛋白质原液定量配制成上样缓冲液，100 ℃下10 min变性，然后放在-20 ℃下保存。

对蛋白质进行分析，加入30～50 μg溶解的蛋白质，通过10%～15% SDS-PAGE电泳分离(约2 h)并转移至PVDF膜(约2.5 h)，然后将载有目的蛋白的PVDF膜在室温(25 ℃)浸没于5%脱脂乳中孵育1 h，纯水洗涤后与一抗G6Pase、PEPCK孵育。在摇床上过夜(4 ℃)。然后TBST洗涤膜并在室温下与二抗孵育1～2 h，通过增强化学发光(ECL)检测靶蛋白。为了量化蛋白质表达水平，在Image J软件上对应于每个样品的印迹强度获得密度测定的图下面积。即获得目的蛋白条带，分析比较不同组间的差异。

2 结果

2.1 血清FT3、FT4检测造模28 d后，每组分别取3只小鼠测血中FT3、FT4，以判断甲状腺功能亢进甲状腺功能减退造模是否成功。经试剂盒检测N组FT3浓度为(55.40±5.15)pmol/L，Pe组FT3浓度为(85.25±5.35)pmol/L，Po组FT3浓度为(20.72±2.23)pmol/L。N组FT4浓度为(58.41±3.53)pmol/L，Pe组FT4浓度为(86.07±2.39)pmol/L，Po组FT4浓度为(20.83±2.50)pmol/L。与N组相比，Pe组FT3、FT4水平升高(t=4.02,P<0.05;t=6.49,P<0.01)，Po组FT3、FT4水平降低(t=6.18,P<0.01;t=8.69,P<0.01)。见图1。

2.2 体质量及血糖检测造甲状腺功能亢进甲状腺功能减退模型从雌性小鼠青春期(4周龄)起，Pe组体质量从造模21 d逐渐与Po组、N组拉开距离，生长加快。造模结束(28 d)N组体质量(18.23±0.13)g，Pe组体质量(20.20±0.56)g，Po组体质量(16.77±0.23)g。与N组相比，Pe组体质量水平升高(t=3.45,P<0.01)，Po组体质量水平降低(t=5.71,P<0.01)。

图1 各组血清FT 3、FT 4检测与N组比较：*P<0.05，**P<0.01

造甲状腺功能亢进甲状腺功能减退模型从雌性小鼠青春期(4周龄)起，Pe组血糖从造模7 d逐渐与N组、P0组拉开距离，血糖降低；Po组血糖从造模14 d逐渐与N组拉开距离，血糖升高。造模结束(28 d)N组血糖(5.23±0.26)mmol/L，Pe组血糖(4.12±0.22)mmol/L，Po组血糖(7.33±0.58)mmol/L。与N组相比，Pe组血糖水平降低(t=3.30,P<0.01)，Po组血糖水平升高(t=5.18,P<0.01)。甲状腺功能亢进鼠呈低血糖状态，甲状腺功能减退鼠呈高血糖状态，见图2。

2.3 肝脏组织中G6Pase、PEPCK的表达G6Pase和PEPCK是催化糖原异生的决定性蛋白，因此在葡萄糖稳态中起关键作用。G6Pase蛋白的表达在各组有差异。与N组相比，Pe组蛋白表达水平升高(t=8.50,P<0.01)，Po组体蛋白表达水平升高(t=3.40,P<0.05)。PEPCK蛋白的表达略有不同。与N组相比，Pe组蛋白表达水平升高(t=14.92,P<0.01)，Po组蛋白表达无差异(t=2.43,P>0.05)，见图3。

3 讨论

3.1 甲状腺激素对青春期生长的短期影响甲状腺激素被称为代谢、生长发育的调节剂，促进雌性小鼠青春期生长。甲状腺功能亢进导致青春期雌性小鼠体质量增加迅速，甲状腺功能减退导致体质量增加缓慢。Shiraki et al[5]研究发现甲状腺功能减退导致体质量降低，Kiyohara et al[6]研究结果表明甲状腺功能减退状态可能对青春期发育产生负面影响，体质量增长的变化与本研究结果一致。甲状腺激素紊乱对雌性小鼠不同生长阶段作用略有区别，有研究[7]指出老年雌性甲亢甲减小鼠体质量均降低，这可能是由于青春期促生长作用更明显。流行病学调查显示，儿童期缺乏甲状腺激素是矮小症患儿发病的重要原因[8]。研究[1]表明下丘脑-垂体-甲状腺轴和下丘脑-垂体-性腺轴之间存在相互作用。青春期是重要的生长发育时期，甲状腺激素紊乱对其影响不仅仅体现在生长方面，而且对女性青春发动期的性腺发育及性器官成熟有重要意义。本研究的不足之处在于没有进一步探究对雌性小鼠青春期发育的影响。

图2 体质量及血糖检测

A：造模期体质量；B：造模期血糖；C：造模28 d体质量；D：造模28 d血糖；与N组比较：*P<0.05，**P<0.01

图3 肝脏组织中G6P、PEPCK的表达

A：肝脏组织中G6P、PEPCK的蛋白条带；B：肝脏组织中G6P、PEPCK各自与β-actin的比值；与N组比较：*P<0.05，**P<0.01

3.2 甲状腺激素与糖异生相关蛋白的表达甲状腺激素与能量代谢的调节密切相关，与糖代谢的调节也是密不可分。甲状腺功能亢进状态下，葡萄糖氧化率增加，胰岛素敏感性降低[9]。有研究[10]表明甲状腺素可增加大鼠卵巢中葡萄糖转运蛋白4表达。甲状腺激素通过这些可能的途径影响糖代谢水平。

与N组相比，甲状腺功能亢进小鼠G6Pase蛋白表达水平升高(t=8.50,P<0.01)，PEPCK蛋白表达水平升高(t=14.92,P<0.01)。这两种催化糖原异生的蛋白表达水平升高，糖异生增强。然而甲状腺功能亢进小鼠血糖水平却降低，可能是由于葡萄糖氧化率增加，葡萄糖转运蛋白表达水平提高导致糖异生的速度赶不上葡萄糖消耗的速度，能量用于生长所需以及维持加速的循环系统运转。

与N组相比，甲状腺功能减退小鼠G6Pase催化糖原异生的蛋白表达增强(t=3.40,P<0.05)，糖异生增强。同时甲状腺功能减退会降低胃肠道葡萄糖的吸收，肝脏葡萄糖生成几乎完全停止以及胰岛素水平增加[9]。甲状腺功能减退小鼠血糖水平升高明显，可能是由于葡萄糖生成途径增加以及能量代谢减慢叠加的效果。

3.3 甲状腺激素与血糖水平的意义一项对德国和奥地利276名儿童和青少年1型糖尿病(diabetes mellitus type 1, T1DM)患者的甲状腺功能亢进症调查表明，伴有甲状腺功能亢进的T1DM患者低血糖发生率更高[11]。甲状腺功能亢进与胰岛素不足是否存在相关性值得引起注意，更高的低血糖发生率对伴有甲状腺功能亢进的T1DM患者并发症防治具有前瞻性意义。格雷夫斯眼病(自身免疫性甲状腺相关性眼病)患者存在自发性低血糖。青春期甲状腺功能亢进可能需预防低血糖的风险。

有队列研究[12]表明甲状腺功能减退是新发糖尿病的危险因素。与N组相比，该研究中雌性小鼠的血糖水平升高(t=5.18,P<0.01)，青春期甲状腺功能减退存在发展成为2型糖尿病的潜在风险，高血糖的持续状态甚至可能影响雌性小鼠成年期。

甲状腺疾病对青春期女性的危害不容忽视。但甲状腺激素水平影响糖脂代谢的信号通路的哪些环节，相关分子机制需要进一步的探索。这或许为女性青春期甲状腺功能紊乱治疗提供新的视角。