慢性不可预知应激所致抑郁小鼠中缝背核脑区BDNF表达的变化

孟凡涛，刘 晶，王文涛，代娟娟，游晶晶，胡凤爱，李 晨

抑郁症又称抑郁障碍，是一种普遍存在的、严重的、并且容易复发的精神疾病，以显著而持久的心境低落和快感缺失为主要特征[1]。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是一种重要的神经营养因子，其基因存在多种剪切体，并且每个剪切体都有特定的启动子调控[2]。研究[3-5]报道前额叶皮层和海马的BDNF在抑郁症发病、围产期应激或青少年应激诱导成年后抑郁行为以及抗抑郁治疗中起着重要作用。此外，研究报道中缝背核5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)神经元广泛地投射到海马和前额叶皮层脑区[6]；中枢神经系统中5-HT功能降低、释放减少及突触间隙含量下降与抑郁症的发生密切相关[7-8]。但是中缝背核脑区BDNF在抑郁症发病中的作用尚未报道。该研究利用慢性不可预知应激(chronic unpredictable stress，CUS)小鼠抑郁模型，结合实时荧光定量PCR(Q-PCR)和Western blot检测中缝背核脑区BDNF的变化情况，为研究抑郁症的发病机制提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 20只雄性SPF级C57BL/6小鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司(生产许可证号：SCXK(鲁)20140007)，自由饮水和饮食，环境温度19～22 ℃，相对湿度40%～60%。本研究中动物实验均经本单位动物伦理委员会批准。

1.1.2主要试剂和仪器 总RNA提取试剂盒(美国Omega公司)；RNA反转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；RIPA裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)；兔抗BDNF单克隆抗体，鼠抗5-HT多克隆抗体(英国Abcam公司)；鼠抗β-actin单克隆抗体(美国Cell signaling公司)；羊抗兔二抗IR Dye800CW，驴抗鼠二抗IR Dye680LT，双红外激光成像系统Odyssey Sa(美国Li-COR公司)；ALexa fluor 488驴抗鼠荧光二抗、ALexa fluor546驴抗兔荧光二抗(美国Thermo Fisher公司)。共聚焦显微镜购自日本东京奥林巴斯有限公司(FV1200)、Real-time PCR仪(StepOnePlus)(美国麻省ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1CUS抑郁模型的建立 20只小鼠按随机数字表法分成对照组与模型组，每组各10只。第1天束缚2 h，第2天24 h光照，第3天电击10 min(0.3 mA电击2 s，间歇16 s，共10 min)，第4天夹尾15 min，第5天高台30 min，第6天24 h湿盒并倾斜45°，第7天冷水游泳(8 ℃)，第8天束缚2 h，第9天24 h光照，第10天电击10 min(0.3 mA电击2 s，间歇16 s，共10 min)，第11天夹尾15 min，第12天高台30 min，第13天24 h湿盒并倾斜45°，第14天冷水游泳(8 ℃)，第15天束缚2 h，第16天24 h光照，第17天电击10 min(0.3 mA电击2 s，间歇16 s，共10 min)，第18天夹尾15 min，第19天高台30 min，第20天24 h湿盒并倾斜45°，第21天冷水游泳(8 ℃)，抑郁模型组小鼠单笼饲养，应激结束后经抑郁样行为试验评判模型是否成功的指标。

1.2.2糖水偏好试验(sucrose preference，SPT) 慢性应激21 d结束后，剥夺饮水5 h，2个相同的水瓶分别放置鼠笼的2侧，水瓶内分别装有1%蔗糖水与饮用水，测定夜间12 h内小鼠的糖和水的消耗量，糖水饮用量占糖和水总饮用量的百分比反映小鼠快感缺乏程度。

1.2.3强迫游泳试验(forced swimming test，FST) 将小鼠放置于透明树脂水桶中，水温24 ℃，强迫游泳6 min，记录小鼠后4 min内静止不动的时间，以小鼠在绝望环境中试图逃脱又无法逃脱的状态评判小鼠的抑郁程度。

1.2.4RNA提取、cDNA合成及Q-PCR 按照组织总RNA提取试剂盒(美国Omega公司)说明书提取海马总RNA，然后利用RNA反转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)将RNA反转录合成cDNA，最后用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒进行Q- PCR检测相关基因表达水平，20 μl反应体系，具体反应条件：95 ℃、 5 min ，95 ℃、 10 s，60 ℃、 30 s，40个循环，并建立溶解曲线95 ℃、 15 s ，60 ℃、 60 s，95 ℃、 15 s。以Actin作为内参基因。以溶解曲线确定PCR反应的特异性，根据荧光曲线的循环阈值(cycle threshold，CT)，按照ΔΔCT方法计算基因的相对表达量。引物序列如下[9-10]：总 BDNF mRNA：上游引物：5′-GCGCCCATGAAAGAAGTAAA-3′，下游引物：5′-TCGTCAGACCTCTCGAACCT-3’；Exon I：上游引物：5′-CTAGCCACCGGGGTGGTGTAA-3′，下游引物：5′-AGGATGGTCATCACTCTTCTC-3’；Exon II：上游引物：5′-CTAGCCACCGGGGTGGTGTAA-3′，下游引物：5′-AGGATGGTCATCACTCTTCTC-3’；Exon IV：上游引物：5′-CAGAGCAGCTGCCTTGATGTT-3′，下游引物：5′-GCCTTGTCCGTGGACGTTTA-3’; Exon VI:上游引物：5′-CTGGGAGGCTTTGATGAGAC-3′，下游引物：5′-GCCTTCATGCAACCGAAGTA-3’；Actin：上游引物：5′-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3′，下游引物：5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3’。

1.2.5Western blot CUS结束后，小鼠断头，并在冰上迅速分离海马，置液氮中速冻，-80 ℃保存备用。取出海马用含1% PMSF的RIPA裂解液进行裂解，然后加入5×上样染料，沸水煮10 min，然后用12% 或15% SDS-PAGE 胶进行分离，并转到PVDF 膜上，膜用TBST buffer (20 μmmol/L TRIs-HCl, pH 7.4, 150 μmmol/L NaCl, 0.1% Tween-20)配制的5%脱脂奶粉封闭1 h，然后 经过一抗(1 ∶1 000)过夜孵育，加荧光二抗(1 ∶5 000)室温孵育1 h， 经Odyssey Sa双红外激光成像系统成像并进行灰度识别分析。

1.2.6免疫荧光 脑片制备 C57BL/6小鼠，4%水合氯醛深度麻醉后，经4%多聚甲醛固定后，取脑组织，经30%蔗糖水脱水后进行冰冻切片，厚度40 μm。免疫荧光染色：取中缝背核脑区的脑片经封闭液封闭后，加入一抗混合液(兔抗BDNF 1 ∶200，鼠抗5-HT 1 ∶500)4 ℃孵育过夜，加入二抗混合液(ALexa fluor488驴抗鼠二抗1 ∶400，ALexa fluor 546驴抗兔二抗1 ∶400)4 h，封片剂封片，最后用共聚焦显微镜观察并拍照。

1.3 统计学处理采用Graphpad Prism 6.0 进行统计分析并制图。用Shapiro-Wilk检验验证各组的正态分布情况。相关性分析用Pearson’s correlation coefficient 进行检验。各组数值以表示，两组间比较采用T检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CUS模型小鼠抑郁行为表型检测糖水偏好和强迫游泳试验结果：小鼠按照试验设计流程进行21 d CUS，并在第22天进行SPT，第23天进行FPT，第24天分离中缝背核收取组织，见图1A。结果显示，与Control比较，CUS组小鼠糖水偏好值明显降低(t=2.368，P<0.05)，见图1B。FPT结果显示CUS组小鼠不动时间明显高于Control组(t=2.773，P<0.05)，见图1C。Shapiro-Wilk检验各组数据均符合正态分布(P>0.05)。

2.2 中缝背核脑区BDNF和5-HT免疫荧光双标结果BDNF为红色荧光，5-HT为绿色荧光，BDNF和5-HT两种蛋白荧光重叠之后呈现黄色，见图2，结果表明中缝背核5-HT神经元中有BDNF表达。

A：CUS模型试验步骤设计图；B： SPT； C：FST； 与Control组比较：*P<0.05

2.3 CUS组和Control组小鼠中缝背核BDNF mRNA和蛋白表达量BDNF mRNA检测结果显示，与Control组比较，CUS组BDNF mRNA表达量明显降低(t=3.56，P<0.01)，见图3A。BDNF蛋白Western blot，见图3B；数据统计分析结果，见图3C，CUS组BDNF蛋白表达量明显降低(t=2.713，P<0.05)。Shapiro-Wilk检验各组数据均符合正态分布(P>0.05)。

2.4 CUS所致小鼠抑郁样行为与中缝背核BDNF mRNA相关性分析结果CUS所致小鼠抑郁样行为与总BDNF mRNA相关性分析结果显示，CUS组小鼠糖水偏好值与总BDNF mRNA存在显著正相关性(P<0.05)，见图4A，CUS组小鼠强迫游泳实验不动时间与总BDNF mRNA存在显著负相关性(P<0.05)，见图4B。Shapiro-Wilk检验各组数据均符合正态分布(P>0.05)。

2.5 CUS组和Control组小鼠中缝背核BDNF exons mRNA表达量与Control组比较，CUS组BDNF Exon I mRNA表达量没有显著变化(t=0.509，P>0.05)，见图5A； Exon II mRNA表达量没有显著变化(t=0.916，P>0.05)，见图5B； Exon IV mRNA表达量明显降低(t=2.798，P<0.05)；Exon VI mRNA表达量明显降低(t=2.419，P<0.05)。Shapiro-Wilk检验各组数据均符合正态分布(P>0.05)。

图2 BDNF和5-HT免疫荧光双标结果 ×200A：有一抗组；B：无一抗组；1：BDNF蛋白染色；2：5-HT染色；3：BDNF和5-HT染色合并图

图3 CUS组和对照组小鼠中缝背核BDNF mRNA和蛋白表达水平

A： BDNF mRNA水平；与Control组比较：*P<0.05；B：BDNF蛋白水平Western blot图；C：BDNF蛋白水平Western blot统计图；与Control组比较：*P<0.05

图4 CUS所致小鼠抑郁样行为与中缝背核BDNF mRNA相关性分析

A：SPT与BDNF mRNA相关性分析结果；B：FST与BDNF mRNA相关性分析结果

图5 CUS组和Control组小鼠中缝背核BDNF exons mRNA表达水平

A：Exon I；B:Exon II；C：Exon IV；D：Exon VI；与Control组比较：*P<0.05

3 讨论

人类抑郁症的核心症状是快感缺乏症，即无法体验快乐。对蔗糖溶液的偏好超过了对水的偏好实验已被用作衡量啮齿动物对自然奖励的快感反应，而被强迫游泳实验被广泛用于评估绝望行为，其中的不动时间被称为“绝望”。这两个行为被广泛用于抑郁样和抗抑郁行为的评价[11]。本研究证明CUS能诱导小鼠产生糖水偏好降低和强迫游泳不动时间增加的抑郁样行为，说明建立的模型能够反映抑郁症的主要表型。

BDNF作为一种重要的神经营养因子，其在神经元的分化、再生、存活及神经和突触可塑性中发挥重要作用[12]。研究[5]报道BDNF在抑郁症的发病机制和抗抑郁治疗中起重要作用，但是其研究脑区主要位于前额叶皮层、海马、中脑腹侧被盖区及伏隔核等。最近一篇研究[13]报道中缝背核脑区特异性敲除BDNF后小鼠在基础条件下糖水偏好和强迫游泳实验均没有表现出抑郁样行为。本研究证明中缝背核脑区5-HT神经元与BDNF共存，说明5-HT神经元中有BDNF表达，CUS能导致总BDNF mRNA和蛋白表达量降低，这与抑郁状态下BDNF在其他脑区的变化一致[14]，说明中缝背核脑区5-HT神经元中的BDNF的确也参与了抑郁症发病。BDNF有多个剪切体，文献[5, 15]报道不同剪接体的空间分布和功能不同[15]，但是不同剪切体的具体生物学功能目前尚不清楚，其中Exon IV和Exon VI在精神疾病的发病和治疗中发挥更重要的作用，这与本研究结果CUS能特异性降低中缝背核脑区BDNF Exon IV和Exon VI的表达一致，这进一步说明中缝背核脑区BDNF与抑郁症的发病相关。

综上所述，本研究证明CUS能显著诱导小鼠产生抑郁样行为，中缝背核脑区5-HT神经元中存在BDNF的表达，并且CUS能显著降低中缝背核脑区BDNF的表达。以上结果提示中缝背核脑区BDNF参与抑郁症的发病，但是其发挥作用的具体机制还需进一步研究。