糖尿病大鼠心肌功能的改变及其机制*

白淑芝， 徐 娜， 王跃虹， 李鸿珠， 李宏霞

(哈尔滨医科大学病理生理学教研室， 哈尔滨 150086)

糖尿病发病率逐年增高，其中90%为2型糖尿病[1]。糖尿病患者有约一半死于心脑血管疾病。糖尿病心肌病( diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病重要合并症之一，它可导致心功能障碍、甚至心衰，发病机制十分复杂，至今尚未完全阐明[2]。钙离子在调控心脏舒缩功能中发挥非常重要的作用。钙敏感受体(calcium-sensing receptor, CaSR)属于G蛋白耦联受体超家族C家族第Ⅱ组成员，在平滑肌、肾脏、甲状旁腺等脏器表达，参与调节甲状旁腺素、降钙素、胃泌素等的调节。2003年首次发现CaSR在心脏有表达，并参与调节细胞内钙稳态[3]。研究发现CaSR参与心肌缺血/再灌注损伤、心肌肥大和动脉粥样硬化等疾病的发生发展，但CaSR在2型糖尿病心功能降低中的作用鲜见报道。本研究旨在探讨CaSR与DCM心功能障碍之间的关系，为进一步揭示DCM的发生机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与器材

CaSR 抗体购自Alpha Diagnostic International Inc.公司，GAPDH 多克隆抗体、PKC抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司；链脲佐菌素(streptozocin, STZ)购自美国Sigma公司，蛋白定量试剂盒购自北京碧云天，其他试剂为国产分析纯。主要器材包括 BECKMAN 低温离心机，酶标仪 (DG3022 A) ，Western blot 电泳槽( 北京六一厂) 等。

1.2 2型糖尿病模型建立

Wistar健康雄性大鼠24 只，体重为180～220 g，购自哈尔滨医科大学附属二院动物研究所。将大鼠于 22℃ ～ 24℃、12 h∶ 12 h 昼夜循环的安静环境饲养 1 周后，随机分为 3 组: (1) 正常对照组(C); (2) 糖尿病 4 周组(D4) ; (3) 糖尿病 8 周组(D8)(n=8)。对照组大鼠给予自由饮食、饮水，糖尿病组大鼠喂养高糖高脂饮食( 成分: 67% 基础饲料，10% 猪油，20% 糖，1% 胆酸钠，2% 胆固醇)。4周后，大鼠禁食 12 h，将佐链脲菌素(STZ)溶于 0.1 mol /L 枸橼酸钠溶液中备用。糖尿病组大鼠给予腹腔注射STZ(30 mg /kg)，对照组单独注射等量的枸橼酸钠溶液。72 h后检测血糖，血糖高于16.7 mmol /L 为造模成功，如果未成功，补充动物再造模。糖尿病组大鼠继续给予高糖高脂饮食，同时监测各组大鼠血糖、饮食、饮水量，直至实验结束。

1.3 HE染色

用中性10%福尔马林将新鲜的心肌组织固定，然后不同浓度乙醇逐级脱水、二甲苯透明、浸蜡后用液体石蜡包埋组织块。用切片机将包埋好的组织块切5 μm厚的切片，用苏木精染色和伊红进行病理染色、封片，于Olympas光学显微镜下观察心肌细胞的形态学变化。

1.4 心脏功能检测

用10%水合氯醛(0.3 ml/kg)将大鼠麻醉，心区剃毛，用GE VIVID7 10S 探头(10 MHz)置于大鼠左胸前进行彩色多普勒超声心动图二维成像与TDI技术测定大鼠心脏的结构和功能参数。于胸骨旁左室长轴切面，腱索水平用M型超声测量心脏参数：左室收缩末期腔内径(LV end-systolic diameter, LVESD)、左室射血分数(LV ejection fraction, LVEF)、左室缩短分数(LV fractional shortening,LVFS)。于心尖四腔切面彩色多普勒频谱测定舒张早期二尖瓣血流速度(E)、舒张早期二尖瓣环运动速度(E')，通过E/E′来评价左室舒张功能。一般采取3～5个心动周期测量的数据，取其平均值。超声测量参照美国超声心动图学会制定的标准。

1.5 Western blot检测CaSR和PKC-α蛋白表达

取各组大鼠心室肌组织，在研钵中用液氮充分研磨后加入组织裂解液，混匀后置于4℃ 裂解 1 h，每15 min混匀一次。然后用低温离心机12 000 r/min离心20 min，上清液即为要提取的总蛋白。取 50 μg 总蛋白样品进行 10% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转印至 PVDF 膜，分别用 CaSR 抗体( 1∶ 2 000) 、PKC-α( 1∶ 500)、GAPDH( 1∶ 500) 抗体， 4℃ 震荡过夜。用二抗(1∶ 5 000 的兔抗鼠 IgG 二抗;1∶ 5 000 的羊抗兔IgG 二抗) 孵育 1 h 后显色。在凝胶成像系统下拍照、分析。计算各蛋白条带的光密度值，蛋白表达水平以其与内参 GAPDH 光密度比值来表示。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠饮食、饮水量和血糖的变化

实验期间，糖尿病大鼠血糖一直高于 16.67 mmol/L,说明造模成功。与正常对照组大鼠相比，糖尿病组大鼠表现出饮水量增加，饮食量增加，且随着病程延长逐渐加重(P<0.05，表1)。

GroupWater intake(ml/d)Food intake(g/d)Glucose( mmol/L)C26.0±2.012.8±1.24.9±0.1D4185.0±4.9∗37.9±2.5∗28.9±2.4∗D8239.0±5.6∗#47.1±2.8∗#26.4±1.9∗

C: Control group; D4: Diabetic-4 week group; D8: Diabetic-8 week group

*P<0.05vsC group;#P<0.05vsD4 group

2.2 各组大鼠心肌组织形态学的变化

正常对照组心肌细胞排列整齐，心肌细胞核大小均一，细胞浆染色均匀。糖尿病组心肌细胞排列紊乱，胞浆染色不均一，心肌细胞核大小不甚规则，出现不规则收缩带，糖尿病8周组更为明显(图1)。

Fig.1HE staining in the myocardium of rats (×200)

C: Control group; D4: Diabetic-4 week group; D8: Diabetic-8 week group

2.3 各组大鼠心脏功能的变化

与对照组相比，糖尿病4周组LVESD、E/E′升高，LVEF、LVFS降低，糖尿病8周组更为明显，说明糖尿病大鼠出现了心肌收缩和舒张功能障碍(表2)。

2.4 各组心肌组织CaSR和PKC-α蛋白表达的变化

通过Western blot 检测大鼠心肌组织CaSR和PKC-α蛋白的表达，与对照组相比，糖尿病4周组CaSR表达减少，PKC-α表达升高，糖尿病8周组变化更为明显(表3)。

GroupLVESDLVEFLVFSE/E'C3.48±0.2474.32±3.5339.78±3.1919.35±1.39D44.54±0.25∗71.70±1.46∗33.30±3.12∗24.25±2.88∗D84.83±0.14∗63.10±2.90∗#31.53±1.46∗29.71±1.90∗#

LVESD： Left ventricular end-systolic diameter； LVEF： LV ejection fraction； LVFS： LV fractional shortening； E： Early transmitral peak diastolic flow velocity; E′： Peak early diastolic tissue velocity; C: Control group; D4: Diabetic-4 week group; D8: Diabetic-8 week group

*P<0.05vsC group;#P<0.05vsD4 group

Tab.3Protein expressions of CaSR and PKC-α in heart analyzed by Western blot

GroupCaSRPKC-αC0.40±0.030.36±0.03D40.20±0.02∗0.67±0.06∗D80.09±0.01∗#0.73±0.05∗

C: Control group; D4: Diabetic-4 week group; D8: Diabetic-8 week group

*P<0.05vsC group; #P<0.05vsD4 group

3 讨论

本研究复制了大鼠2型糖尿病心肌病动物模型，血糖超过16.7 mmol/L表明造模成功。通过监测发现糖尿病大鼠出现饮食、饮水量明显增加，说明出现糖尿病的症状。通过心肌组织HE染色发现糖尿病大鼠心肌细胞排列紊乱，且出现不规则挛缩带，表明心脏功能出现异常。

多普勒超声心动描记术是一项无创性操作技术，在临床上已经得到了广泛的应用，实验中的糖尿病大鼠也采用心脏超声多普勒检查来评价心脏的功能。通过E/E'来判定左心室舒张功能，通过LVEF、LVFS和LVESD来判定左心室收缩功能[4]。本研究显示，糖尿病大鼠4周后心脏的LVESD升高，LVEF和LVFS降低，而E/E' 升高，病程达到8周后这些变化更明显，与文献报道[5]一致。可见，糖尿病大鼠出现了左心室收缩功能和舒张功能的障碍，且随着病程的延长逐渐加重。

DCM的发生机制十分复杂，迄今尚不十分清楚，一般认为，主要与糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗、钙稳态失衡、线粒体功能异常、心脏自主神经病变以及血管病变等有关[6]。钙离子在调控心脏收缩和舒张过程中发挥重要作用[7]，钙稳态紊乱将直接导致心脏功能异常。DCM时，引起钙稳态失衡的因素有RyR、SERCA2a、NCX、LTCC和ATP敏感钾通道蛋白表达/活性改变以及肌丝对Ca2+敏感性降低等[8]，关于CaSR在DCM心肌钙稳态紊乱中的作用报道较少。

CaSR激活通过G蛋白-PLC-IP3通路导致 [Ca2+]i升高[9]。本实验结果表明随着病程延长，CaSR蛋白的表达逐渐降低，由此可以推测其变化可能引发细胞内钙调节发生紊乱，可导致心功能降低。

研究表明，慢性高血糖是糖尿病心血管合并症的主要始动因子。在糖尿病发生发展过程中，高血糖可激活PKC等多条信号通路[10]。PKC激活，可引起心肌细胞结构和功能改变，严重可导致心力衰竭,运用PKC抑制剂可以改善此变化[11]。本研究表明Western blot 检测大鼠糖尿病心肌组织PKC-α表达升高。有报道在2型糖尿病心肌病早期，高血糖能增加甘油二酯和游离脂肪酸的合成，过多的甘油二酯可引起PKC-α表达增强[12]。文献报道，PKC可抑制CaSR的功能，而尤其是PKC磷酸化CaSR T888位点，抑制CaSR介导的细胞内钙升高。本研究显示，高血糖所致的PKC-α的激活引起CaSR表达降低，将会导致细胞内钙稳态紊乱，从而引起心脏收缩和舒张功能出现异常。在糖尿病心肌病中，CaSR是否也通过PLC-IP3通路调控细胞内钙导致糖尿病心肌病心功能紊乱的确切机制，在后续的研究中将进一步探讨。