新型Rho激酶抑制剂FSD-C10对阿尔茨海默病模型小鼠的神经保护作用*

谷青芳， 尉杰忠， 郭敏芳， 魏文悦， 肖保国， 张光先， 马存根△

(1山西大同大学神经炎症及变性疾病基础与应用研究山西省重点实验室， 山西 大同 037009； 2山西医科大学， 山西 太原 030000； 3复旦大学华山医院神经病学研究所， 上海 200025； 4托马斯·杰弗逊大学神经学系， 美国 宾夕法尼亚州 费城 19107)

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种主要发生在老年人的神经退行性疾病，随着我国老龄化社会的到来，AD 患者数量迅速上升，给家庭和社会带来沉重的负担。AD 的形成有多种病因，但其确切的发病机制尚不清楚[1]。β淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)和tau蛋白构成了AD患者大脑中老年斑的主要神经毒性成分，这2种蛋白质的斑块和缠结破坏了大脑的神经元，损害了病人的记忆从而导致学习和记忆障碍[2]。迄今为止，大多数旨在改变单一病理因素(例如胆碱能功能障碍或Aβ异常沉积)的治疗措施都失败了，因为它们只针对有限的AD致病因素[1-2]。

Rho激酶是近十年来发现参与细胞诸多活动的主要激酶之一。Rho相关激酶(Rho-associated kinase，ROCK)的异常激活也已在AD实验模型脑中被发现，并且可能参与AD疾病的发生和发展[3]。值得注意的是激活Rho激酶信号通路，可导致生长锥的萎缩和轴突生长抑制，而ROCK抑制剂可以明显促进脊髓损伤后小鼠轴突再生和功能恢复[3]，ROCK抑制剂Y-27632对各种原因导致的神经损伤均具有抑制作用，可增加神经元的存活和神经突起的延长[4-6]，因此ROCK通路可能是促进中枢神经保护的主要信号通路。因此，近年来寻找能够拮抗突触再生抑制分子或阻断其与受体结合通路的ROCK抑制剂成为研究热点。新近的ROCK抑制剂系列研究已证明ROCK抑制剂在中枢神经系统损伤的修复中发挥重要作用[3-6]，Rho激酶抑制剂将为促进AD神经保护和功能恢复提供新的思路和作用靶点。

多年来人们一直在寻找高效低毒的新型Rho激酶抑制剂。我们前期筛选了一系列合成的新型Rho激酶抑制剂衍生物，选择FSD-C10与fasudil进行了一系列的对比实验。在发现FSD-C10具有与fasudil诸多相似的生物学特征基础上，证实FSD-C10具有细胞毒性低和对血管影响小等优势[7]。本研究试图在此基础上研究FSD-C10治疗AD动物模型的效果，并进一步探讨其在神经变性病变中的免疫调节及神经保护机制。

材 料 和 方 法

1 实验动物

清洁级雄性8月龄APP/PS1双转基因(transgenic，Tg)小鼠20只(体重18～22 g)，同窝同性别8月龄野生型C57BL/6小鼠10只(体重18～20 g)。实验动物置于室温和光照可控的无菌动物房清洁饲养[(25±2)℃，12 h 明暗交替，相对湿度40%]。该实验按照国际实验动物科学理事会的指导方针进行，并得到了山西大同大学动物伦理委员会的批准(伦理批准号：1601)。

APP/PS1Tg小鼠购自上海南方模式生物科技发展有限公司，可表达人的APPswe基因与早老素PS1-dE9基因，能产生高水平的Aβ1-42纤维沉积，在8月龄时可出现Aβ老年斑，是国际通用的AD模型鼠之一。APP/PS1Tg实验小鼠随机分为模型(NS)组与FSD-C10治疗组，分别持续腹腔注射给予生理盐水(0.9% NaCl，n=10)和FSD-C10(25 mg·kg-1·d-1，n=10) 2个月，野生(WT)组取10只正常老龄小鼠同法给予等量生理盐水。

2 主要试剂和仪器

FSD-C10化合物购自天津红日药业股份有限公司；兔抗小鼠Aβ1-42抗体(Millipore)；兔抗小鼠磷酸化tau蛋白(phosphorylated tau, p-tau)、第668位苏氨酸磷酸化的淀粉样前体蛋白[phosphorylated amyloid precursor protein at Thr668, p-APP (Thr668)]、β位点APP剪切酶1 (beta-site APP-cleaving enzyme 1, BACE1)、突触后致密区蛋白95(postynaptic density protein 95, PSD-95)抗体购自Cell Signaling Technology；抗突触小泡蛋白(synaptophysin)和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸受体(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor, AMPAR)抗体购自Abcam。

水迷宫软件SMART 3.0及硬件购自深圳瑞沃德生命科技有限公司；冰冻切片机购自Leica；酶标仪购买于THERMO；凝胶成像分析仪购自Bio-Rad。

3 方法

3.1莫里斯水迷宫(Morris water maze，MWM)实验 MWM是一个高50 cm，直径90 cm的圆形水池，水池装满用食用白色素调和形成的不透明的水，水温维持在21～23 ℃。 MWM通过 SMART 3.0软件分为4 个象限：西北(northwest，NW)、东北(northeast，NE)、西南(southwest，SW)和东南(southeast，SE)象限。在SW象限放一个逃生平台(5.0 cm×5.0 cm)，低于水面2.0 cm。每次实验中，训练小鼠从起点到达平台的时间和距离，时长每次60 s，如果在60 s期间小鼠没有到达平台，则引导帮助小鼠到达平台，训练完成后，对认知功能进行5 d的认知功能测定，然后将平台移除进行空间探索，以确定小鼠对平台空间位置的记忆能力。实验过程中，小鼠游动的踪迹被SMART 3.0系统摄像头跟踪记录并分析处理各项指标，包括动物从入水到平台的时间、动物第1次到达平台所在象限时间、动物达到平台的平均距离、动物在平台所在象限待的时间占总时间的比例、动物在平台所在象限游的路径距离占总路径距离的比例、动物在平台所在象限活动度占总活动度的比例，通过比较时间和距离判断小鼠对平台空间位置的记忆能力。

3.2标本采集 水迷宫实验结束后，腹腔注射100 g/L 的水合氯醛(每只0.2 mL)麻醉小鼠。每组取5只小鼠用4%多聚甲醛灌流进行体内组织固定，然后分离脑组织，OTC包埋后切10 μm冠状冰冻切片，-80 ℃保存，进行组织免疫荧光染色。各组剩余5只小鼠冰上快速取脑组织，用组织裂解液在4 ℃条件下裂解组织蛋白，并用BCA法测定蛋白含量，制备蛋白上样缓冲液样品，进行Western blot法检测。

3.3免疫荧光染色 将上述制备的冰冻切片用 PBS 洗3 次，每次5 min；1% BSA室温封闭1 h；I 抗(包括抗Aβ1-42、p-tau、 synaptophysin、 AMPAR-1 和AMPAR-2抗体， 稀释比例为1∶1 000)，4 ℃孵育过夜；次日用PBS洗 3 次，每次5 min；加AlexaFlour 555或AlexaFlour 488荧光标记的 II 抗(1∶1 000，Thermo Scientific)室温孵育2 h， 50% 甘油封片，荧光显微镜观察蛋白的表达和分布。

3.4Western blot法检测蛋白水平 将上述制备的蛋白上样缓冲液样品，用10%(质量浓度)SDS-PAGE分离蛋白，电泳完毕后，将分离好的蛋白凝胶用湿式转移法转移到PVDF膜(稳流200 mA，2 h)。5%(质量浓度)脱脂奶粉封闭2 h，用 5%脱脂牛奶稀释 I 抗[包括抗p-APP (Thr668)、BACE1、synaptophysin、 PSD-95、AMPAR-1 和AMPAR-2抗体，稀释比例为1∶1 000]分别加至膜上，4 ℃过夜。次日洗涤后孵育HPR耦联的 II 抗(稀释比例1∶1 000)室温45 min。洗膜后使用 Bio-Rad 凝胶成像分析仪检测染色条带强度，以检测蛋白条带吸光度与内参照GAPDH或β-actin的吸光度比值表示。

4 统计学处理

数据采用GraphPad Prism 5.0统计软件进行处理。所有实验均重复至少3次，计量资料用均数±标准差(mean±SD)来表示，两组比较采用t检验，3组组间比较采用单因素方差分析及Dunnett’s post-hoc检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 FSD-C10促进APP/PS1 Tg小鼠学习记忆能力的改善

观察新型Rho激酶抑制剂FSD-C10对APP/PS1Tg小鼠的治疗潜力，我们首先以药物干预起始时小鼠的行为和病理变化作为基线来进行比较。首先采取水迷宫实验检测小鼠学习记忆能力，由游泳运动轨迹可见野生组小鼠搜索策略多为直线式和趋向式，小鼠的运动轨迹主要集中在目标平台象限的位置，而AD模型组小鼠搜索策略多为边缘式和随机式，小鼠的运动轨迹多沿着池壁及远离目标平台象限的位置运动，搜索效率明显低于野生组，见图1A。与野生组相比，AD模型组搜索平台逃避潜伏期时间明显增加(P<0.05)，小鼠在平台所在象限滞留时间占总时间的比例和小鼠在平台所在象限游的路径距离占总路径距离的比例明显减少(P<0.01)。而三组小鼠的游泳速度相当，差异没有统计学意义，这表明小鼠在水下平台定位所需的不同时间与运动能力无关，提示AD模型组小鼠认知功能较野生组小鼠下降，AD 模型制备成功。

经过2 个月FSD-C10治疗后，FSD-C10治疗组APP/PS1Tg小鼠的认知功能较AD模型组明显改善，小鼠搜索潜伏期明显缩短(P<0.05)，小鼠在平台所在象限滞留时间占总时间的比例和小鼠在平台所在象限游的路径距离占总路径距离的比例明显增加(P<0.05), 见图1B，提示FSD-C10可有效促进APP/PS1Tg小鼠学习记忆能力改善。

Figure 1.The cognitive ability of the mice in each group was analyzed by Morris water maze (MWM) test. A: the typical diagram of the 3 groups; B: the corresponding parameters of MWM test. Mean±SD. n=10. *P<0.05, **P<0.01 vs NS group.

2 FSD-C10治疗减少APP/PS1 Tg小鼠脑内Aβ沉积

免疫荧光组织化学染色结果显示，FSD-C10组和AD模型组小鼠的大脑皮层及海马齿状回(dentate gyrus，DG)区均有Aβ老年斑阳性表达。AD模型组小鼠脑内Aβ老年斑呈散在分布，数量多，体积大；经FSD-C10治疗后小鼠脑内的上述蛋白数量减少，体积减少，而野生组小鼠大脑海马DG区和皮层区经免疫组织化学染色，未见明显Aβ蛋白阳性反应，见图2。

Figure 2.FSD-C10 attenuated Aβ1-42 and p-tau levels in hippocampal DG area and cerebral cortex of the mice in the 3 groups detected by immunohistochemistry.

3 FSD-C10治疗调节小鼠脑内APP蛋白的代谢

Western blot 结果显示，AD模型组和FSD-C10组小鼠脑内的p-APP (Thr668)蛋白水平均高于野生组小鼠；与AD模型组相比，FSD-C10组小鼠脑内的p-APP (Thr668)蛋白水平明显高于AD组小鼠(P<0.05)，见图3A。这表明FSD-C10促进APP蛋白向非淀粉样途径代谢，导致脑内寡聚体Aβ的减少。另外，FSD-C10治疗后小鼠脑内BACE1 蛋白水平降低：FSD-C10组小鼠脑内的BACE1蛋白水平明显低于AD组小鼠(P<0.01)，但尚未达到野生组水平，见图3B。

Figure 3.The protein levels of p-APP (Thr668)(A) and BACE1 (B) in the brain tissues of the mice in the 3 groups determined by Western blot. Mean±SD. n=5. *P<0.05, **P<0.01 vs NS group.

4 FSD-C10增加APP/PS1 Tg小鼠脑内突触相关蛋白的表达

免疫荧光组织化学染色检测APP/PS1Tg小鼠海马DG区、海马CA3区及皮层区突触相关蛋白的表达，结果显示，与AD模型组相比，FSD-C10治疗组小鼠这些区域出现synaptophysin、AMPAR-1和AMPAR-2蛋白的阳性反应细胞表达，染色较深，海马DG区、海马CA3区及皮层区阳性细胞体积大，呈圆形或椭圆形，见图4A、B。

Figure 4.FSD-C10 induced the expression of synapse-associated proteins. A: FSD-C10 induced the expression of synaptophysin in hippocampal DG area, hippocampal CA3 area and cerebral cortex of the mice in the 2 groups detected by immunohistoche-mistry; B: FSD-C10 induces the expression of AMPAR-1 and AMPAR-2 in hippocampal DG area, hippocampal CA3 area and cerebral cortex of the mice in the 2 groups detected by immunohistochemistry; C: the protein levels of synaptophysin, AMPAR-1, AMPAR-2 and PSD-95 in the brain tissues of the mice in the 2 groups determined by Western blot. Mean±SD. n=5. *P<0.05, **P<0.01 vs NS group.

Western blot 检测APP/PS1Tg小鼠脑内突触相关蛋白的表达，FSD-C10治疗组小鼠脑内synaptophsin、AMPAR-1、AMPAR-2和PSD-95的蛋白表达条带均比对照AD模型组小鼠明显变粗、颜色变深，表明其蛋白表达增加(P<0.05或P<0.01)，见图4C。

因此，我们通过免疫组化和Western blot两种实验方法均证明FSD-C10治疗可上调APP/PS1转基因小鼠突触相关蛋白的表达。

讨 论

AD的病理学特征之一是出现老年斑Aβ。Aβ 是淀粉样前体蛋白APP被一系列蛋白水解酶裂解的产物，是AD的核心致病物质。 正常情况下APP 的代谢途径是α-分泌酶途径，裂解APP产生可溶性的sAPPα片段，可促进神经轴突生长，突触形成；病理情况下APP的代谢途径是β-分泌酶途径，裂解APP产生Aβ1-40和Aβ1-42，它们难溶于水，可聚集形成老年斑。Aβ具有很强的自聚性，只要形成聚集体，就能表现出明显的神经毒性，造成突触损伤，线粒体功能障碍，神经元变性死亡，最终导致AD的发生[8]。在本实验研究中，我们应用新型Rho激酶抑制剂FSD-C10对AD的APP/PS1Tg小鼠模型进行持续 2 个月的治疗，结果显示FSD-C10可有效改善空间认知功能，小鼠脑内的Aβ数量减少，体积变小，提示该治疗在行为学及中枢神经系统病理学的良好效果。 而FSD-C10治疗后APP/PS1Tg小鼠脑内p-APP (Thr668)蛋白表达增多，同时FSD-C10治疗后β-分泌酶BACE1蛋白表达减少，促进了APP蛋白向非淀粉样途径代谢转化，减少小鼠脑内的Aβ老年斑的沉积。这些结果可能是改善小鼠认知功能的直接原因，但FSD-C10如何促进APP蛋白向非淀粉样途径代谢转化其具体的网络机制仍需进一步深入的探讨。

在AD的APP/PS1Tg小鼠模型中，Aβ的病理性升高可诱导突触损失[9]。虽然确切的分子机制尚未完全了解，但是寡聚体Aβ与突触可塑性丧失和神经网络功能障碍有关[10-11]。通常认为Aβ可结合突触相关蛋白使其失活，因此作为AD中突触可塑性丧失的病理机制[10-11]。 突触是神经元之间信息传递的关键性结构，任何突触都可能表现出不断变化的传递效能，这就是突触可塑性[12]。synaptophysin是囊泡形成和胞吐作用所需的突触前囊泡的主要整合膜蛋白[13]，用来检测突触的密度和分布，而AD患者脑海马结构内synaptophysin蛋白含量比正常人明显减少，提示AD患者的海马神经元突触密度下降[14-15]。Bertoni-Freddari等[16]研究发现，皮质和海马突触联系缺失的严重程度与AD的痴呆程度呈正相关。谷氨酸受体在人体海马区中发挥了重要的作用，它属于神经递质受体，参与突触传递，神经元生长和分化，突触可塑性以及学习和记忆[17]。当神经元去极化时，谷氨酸被释放到突触间隙中，与谷氨酸受体结合[18]，参与快速兴奋性突触传递和神经递质的释放，与学习和记忆密切相关[19]。现在的研究已经公认长时程增强(long-term potentiation，LTP)和长时程抑制(long-term depression，LTD)现象是学习记忆活动的细胞水平的生物学基础[20]。在突触后膜，AMPAR能诱发和维持LTP,促进学习记忆行为。相反 AMPAR 从突触后膜移除是 LTD的重要环节。Yasuda等[21]的研究证实，AD 病人海马区域 GluR1和GluR2/3 水平分别下降 43% 和 38%，提示突触后膜 AMPAR 数目和功能的改变可能与 AD 认知障碍的发生有关。PSD-95是一种调节突触分布的重要支架蛋白，PSD-95组织突触蛋白以介导兴奋性突触的功能和结构可塑性并维持突触体内平衡[22]。PSD-95被认为在突触成熟过程中发挥作用，因为它特别容易受到Aβ的毒性作用[23], 因此PSD-95下调可能是由Aβ引起的病理级联事件中的重要中间步骤。FSD-C10治疗后突触可塑性相关蛋白，如synaptophysin、AMPAR和PSD-95蛋白的表达增加。FSD-C10可能通过上调这些突触相关蛋白的表达来维持突触的正常功能。

综上所述，本研究显示新型Rho激酶抑制剂FSD-C10治疗后双转基因AD 模型小鼠认知功能障碍及中枢神经系统病理改变显著改善，其神经保护作用机制可能与促进APP/PS1双转基因小鼠脑内APP蛋白向非淀粉样途径代谢，减少脑内Aβ寡聚体的生成，降低Aβ老年斑的沉积，减少tau蛋白的数量有关。此外，通过上调突触相关蛋白synaptophy-sin、AMPAR及PSD-95的表达，增强突触可塑性，可能是FSD-C10改善APP/PS1Tg小鼠认知功能的重要机制。