解淀粉芽胞杆菌产酶多样性及应用研究进展

王世伟， 王卿惠， 翟丽萍， 刘 军， 于志丹

(1．齐齐哈尔大学 生命与农林学院 抗性基因工程与寒地生物多样性保护重点实验室,黑龙江 齐齐哈尔 161005;2．东北农业大学 生命科学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)属革兰阳性菌，不仅具有广泛抑真菌特性，而且能产生多种重要的酶类。因此，在种植业、养殖业、果蔬采后病害防治、环保、食品安全等领域具有广泛应用前景。本文对解淀粉芽胞杆菌产生的蛋白酶、多糖降解酶、脂类代谢酶和其他相关重要酶类及其应用进行综述。

1 解淀粉芽胞杆菌产生的分解蛋白质的酶类

蛋白酶(Proteinase)是工业中占最大比例的酶类，约占全世界每年总销售量的60%。微生物蛋白酶均为胞外酶，易于实现工业化生产，具有重要研究和应用价值[1]。解淀粉芽胞杆菌产生的蛋白酶包括中性蛋白酶(Neutral proteinase)、碱性蛋白酶(Alkaline protease)、耐受性蛋白酶(Tolerance protease)和专一性蛋白酶(Specific protease)等，深入研究其蛋白酶特性，对提高酶产量和质量进而将其应用于相关科研领域具有重要价值。

1.1 解淀粉芽胞杆菌产生的中性蛋白酶

中性蛋白酶(Neutral proteinase)不但广泛应用于动植物蛋白水解、高级调味品制取和食品营养强化剂生产，还常用于皮革脱毛、软化、羊毛丝绸脱胶等加工行业[2-3]。Wang等[4]为了提高中性蛋白酶表达水平，从解淀粉芽胞杆菌K11菌株中克隆了编码中性蛋白酶基因Banpr，在枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)WB 600中构建了含有Banpr基因的重组质粒并转化菌株K11，筛选到具有最高蛋白酶活性的阳性转化菌110N-6。经100多次传代后，该菌仍具有很强的遗传稳定性。经发酵条件优化，酶活性达(8 995±250) U/mL，高于原始出发菌株和枯草芽胞杆菌AS.1398。可见,利用基因工程方法提高解淀粉芽胞杆菌中性蛋白酶产量和质量，有望在食品和毛皮加工领域得以更好应用。

1.2 解淀粉芽胞杆菌产生的碱性蛋白酶

碱性蛋白酶(Alkaline protease)在pH值偏碱性范围内可有效水解蛋白质肽键，在食品、洗涤及制革等行业中具有很高研究和应用价值[5]。解淀粉芽胞杆菌SP1产生的胞外碱性蛋白酶具有很强耐热性。Guleria等[6]发现SP1菌株产生的蛋白酶是一种分子量为43 kDa的单聚体，在60 ℃碱性环境下活力最佳，在没有化学助剂的情况下仍具有极好地亲和性和催化能力，甚至在接触表面活性剂和氧化剂的情况下仍能保持稳定。其蛋白酶是一种胞外碱性蛋白酶，能抑制尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)生长。Guleria等[7]使用不同浓度藻酸钙、琼脂和聚丙烯酰胺对该蛋白酶进行了固定化，固定化酶可重复利用。角蛋白(keratins)普遍存在于羽毛、头发和羊毛中，其分子间存在高度交联的盐键、氢键、二硫键和其他交联键，结构非常稳定，普通消化酶难以将其有效降解，造成环境污染。生物降解角蛋白具有反应过程高效、节能、不易造成环境污染的优点，而且反应条件温和、降解产物性质稳定，具有广阔的发展潜力和极高实用性[8]。角蛋白酶(Keratinase)属专一降解角蛋白的诱导酶，只有当环境中存在角蛋白(诱导子)时才会合成。Yang等[9]发现解淀粉芽胞杆菌菌株K11具有明显羽毛降解能力(在24 h内完全降解羽毛)，能产碱性角蛋白酶。该角蛋白酶编码基因kerk在枯草芽胞杆菌SCK6中过表达。纯化的重组角蛋白kerk在50 ℃和pH 11.0下表现出最佳活性，存在DTT(Dithiothreitol,二硫苏糖醇)下0.5 h内能迅速降解整个羽毛。从枯草芽胞杆菌SCK6中提取含有该蛋白酶基因的重组质粒，转化解淀粉芽胞杆菌K11。重组解淀粉芽胞杆菌K11在12 h内降解羽毛能力明显增强，反应时间大大缩短，酶活性(1 500 U/mL)提高6倍。这种高效、快速羽毛降解能力在羽毛粉制备和废弃羽毛处理方面具有潜在应用前景。Guleria等[10]从SP1菌株基因组中克隆了碱性蛋白酶基因，该基因由1 149 bp核苷酸组成，能编码382个氨基酸，酶蛋白分子量为43 kDa。该蛋白酶基因在大肠埃希菌BL21中表达，获得的蛋白酶在pH 8.0和60 ℃条件下活性最佳。使用基于拉(氏)图(α-碳与酰胺平面交角图)的Phyre2服务器确定了该碱性蛋白酶三维结构，为深入研究该碱性蛋白酶的性质及商业应用奠定了基础。笔者使用同源模建和底物对接方法研究了RhodococcusruberCGMCC3090腈水合酶空间结构和催化机制，初步阐明了该腈水合酶的底物特异性和宽泛性的作用机制，为该腈水合酶的蛋白质工程提供了科学数据[11]。由此可见，对解淀粉芽胞杆菌蛋白酶进行固定化，构建基因工程菌株提高蛋白酶表达水平，使用“同源模建”预测酶蛋白三维结构深入研究酶的催化机理，将使解淀粉芽胞杆菌蛋白酶在食品、洗涤和制革等领域得到更好应用。

1.3 解淀粉芽胞杆菌产生的耐受性蛋白酶

耐受性蛋白酶(Tolerance protease)在理论和应用上具有重要意义，已成为众多学者研究的热点。一些微生物蛋白酶对多种金属离子、有机溶剂及表面活性剂均有较好耐受性[12]。解淀粉芽胞杆菌蛋白酶对离子液，甚至有机溶液具有良好耐受性。Kurata等[13]研究发现分离于日本豆酱的解淀粉芽胞杆菌CMW1能耐离子液，在10% (体积分数) 1-丁基-3-甲基咪唑氯化物、1-乙基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸盐和1-丁基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸钠等亲水性离子液体中生长良好。该菌产生的胞外蛋白酶(BapIL)，在80%(体积分数)上述离子液中活性仍能保持稳定。该蛋白酶还能耐受其他多种离子液，在pH 4.0～12.6范围内或在4 004 mmol/L NaCl溶液中其活性均保持稳定。特别是该酶在50%(体积分数) 亲水和疏水性有机溶液中也具有活性，耐受性蛋白酶在工业上有重要的应用价值。袁久刚等[14]为提高羊毛表面亲水性，使用对羊毛角蛋白具有良好溶解能力的离子液体(氯化1-丁基-3-甲基咪唑)预处理羊毛蛋白，将离子液体预处理和蛋白酶处理相结合，完成了对羊毛表面的亲水化改性。经过这种“联合”处理，织物润湿时间下降，纤维吸水量增加，织物表面自由能降低。可见，离子液体预处理可以有效促进蛋白酶对纤维的水解能力，预处理后纤维表层亲水性基团增加，织物润湿性能提高，在工业生产上具有明显的优势。

1.4 解淀粉芽胞杆菌产生的纤溶酶和凝乳酶

解淀粉芽胞杆菌还能生产纤溶酶(Plasmin)和凝乳酶(Chymosin)等重要的专一性蛋白酶。在环境保护、医疗行业以及奶酪加工领域有潜在的应用价值。纤溶酶能专一降解纤维蛋白，是纤溶系统的重要组分。随着血栓性疾病临床死亡率的增加，研制开发新型溶血栓药物已经成为人们关注的热点[15]。Yogesh等[16]纯化了分离于多萨面糊的解淀粉芽胞杆菌MCC2606菌株生产的对纤维蛋白具有偏爱性的纤溶酶，该纤溶酶(CFR15)分子量为32 kDa，具有溶解纤维蛋白和纤维蛋白原的水解活性；在镁离子存在的情况下，酶活性显著提高。初始降解产物MS/MS分析表明，在4条纤维蛋白链中，纤维蛋白β链是CFR15蛋白酶早期作用的主要成分和位点，显然CFR15-蛋白酶在医药工业上可作为一种具有潜力的纤维蛋白溶解剂。Ochoa等[17]研究了解淀粉芽胞杆菌FCF-11无毒、可直接作用的纤溶酶，在试管内外评估了其溶栓效果。研究发现纯酶分子量为18.2 kDa，该蛋白酶的Ip为0±0.2，纯化后比酶活增加了443.5倍，产率达17%。乙二胺四乙酸和两种金属酶抑制剂(吡啶和邻菲啰啉)对酶活性没有影响，酶对发色底物S-2586有很高特异性。该酶在试管内可直接作用于血栓，可使凝血时间延长4.1倍。该酶溶栓性能好，分子量低，对其他血浆蛋白无特异性，可作为更安全的溶栓药物。可见，解淀粉芽胞杆菌产生的溶栓酶具有良好的特性，对血栓性疾病治疗具有重要潜力。

凝乳酶最早在未断奶小牛胃中发现，是一种天门冬氨酸蛋白酶，是奶酪工业化生产的关键酶，从动物组织提取明显不足[18]。通过微生物发酵法生产凝乳酶更具有显著优势，是解决酶源、降低成本的有效途径[19]。凝乳酶可专一切割乳中κ-酪蛋白Phe105～Met106之间肽键，破坏酪蛋白从而使牛奶凝结，对奶酪质构和特殊风味形成至关重要。Zhang等[20]为了提高凝乳酶产量，在深层发酵中使用麦麸为营养源，应用两种统计学方法优化了解淀粉芽胞杆菌D4的培养条件。研究发现初始pH、转速和发酵时间显著影响D4菌株凝乳酶产量，使用Box-Behnken获得优化条件，凝乳酶产量显著提高，活性达到1 996.9 SU/mL，比初始反应条件下提高2.92倍。由于解淀粉芽胞杆菌属于益生菌，安全性好，因此将其产生的凝乳酶应用于奶酪工业具有十分广阔的前景。

2 解淀粉芽胞杆菌产生的分解多糖的酶类

2.1 解淀粉芽胞杆菌产生的淀粉酶

淀粉酶(Amylase)能催化水解淀粉分子内糖苷键，是能水解淀粉和糖原的酶的总称。一般以淀粉水解产物异头碳的构型划分为α-淀粉酶和β-淀粉酶。目前已有多种淀粉酶被成功商业化,广泛应用于水解织物上淀粉浆料，提高果汁加工中的过滤速度；还可用于蔬菜加工、糖浆制造、葡萄糖生产及加工领域。解淀粉芽胞杆菌淀粉酶作用底物丰富，在工业生产上具有明显优势。Deb等[21]研究发现解淀粉芽胞杆菌P-001胞外淀粉酶可受不同淀粉底物诱导，玉米粉是最佳底物；对热、碱、表面活性剂、氧化剂和漂白剂均具有很强耐受性(Thermostable amylase)。Prajapati等[22]发现解淀粉芽胞杆菌KCP2能产热耐受性和嗜碱α-淀粉酶。Du等[23]发现解淀粉芽胞杆菌BH072产生的α-淀粉酶分子量68 kDa，N-端10个氨基酸为NSGLNGYLTH，对多种试剂均具有很好的耐受性；在表面活性剂、氧化剂和漂白剂存在下仍能保持稳定。为了研究解淀粉芽胞杆菌耐受性产生的机制，Montor-Antonio等[24]克隆表达了解淀粉芽胞杆菌JJC33的α-淀粉酶(MAmyJ33)基因。研究发现重组α-淀粉酶(AmyJ33r)分子量(72 kDa)比野生α-淀粉酶 (AmyJ33)高出25 kDa，正是由于野生酶和重组酶内部C-末端加工方式才导致其分子量的差异。与野生酶相比，重组酶C-端额外一个区域严重影响酶的活性、特异性和生化行为，使酶失去了水解原料淀粉的活性，但增加了酶的热稳定性和pH稳定性，更改了对碱性pH活力图谱。推测重组酶AmyJ33r催化结构域因受酶C-端额外区域氨基酸的干扰和阻碍，使酶特性发生改变。可见通过基因重组方法，研究酶蛋白的结构域的差异，对更好地改造酶的结构，获得更有适应性的耐受性淀粉酶具有重要意义。为了提高解淀粉芽胞杆菌淀粉酶的热耐受性，Wang等[25]用BAA蛋白表达模仿策略，通过比较不同基因 (mpfa和opfa)、启动子(PamyA和P43)和菌株(F30、F31、F32和F30-△amyA)，在解淀粉芽胞杆菌中成功表达嗜热古细菌的PFA(α-amylase from pyrococcus furiosus,嗜热古细菌α-淀粉酶)，最终酶活达2 714 U/mL。在大约100 ℃和pH 5下重组PFA不需要Ca2+就能保持活性和稳定性；在100 ℃保持4 h仍保留80%酶活。可见，将不同优势淀粉酶进行组合十分重要，酶的耐受性和酶的结构是相关的，酶蛋白上的特定氨基酸结构是其产生不同“耐受性”的基础，因此分析耐受性淀粉酶的结构与耐受性关系具有重要价值。

2.2 解淀粉芽胞杆菌产生的纤维素酶

纤维素酶(Cellulase)能够水解纤维素的β-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖，其作用的底物比较复杂。它不是单体酶而是由起协同作用多组分酶系组成的复合酶，其中各组分功能也存在差异[26]。在纤维素酶系中，内切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanohydrolase, EC 3.2.1.4)是主要成分。Singh等[27]研究了解淀粉芽胞杆菌SS35，发现其eglS基因能编码属于糖基水解酶家族5的内切β-1,4-葡聚糖酶。Fan等[28]构建了eglS基因中断突变菌株，以研究其在植物中的适应性。研究发现，eglS基因失活突变子TB2k胞内纤维素酶活性明显减少，说明内切-β-1,4-葡聚糖酶有利于解淀粉芽胞杆菌种群在植物体内定殖。耐受性纤维素酶(Tolerant cellulase)具有重要应用价值，解淀粉芽胞杆菌纤维素酶对热、酸、盐等具有明显的耐受性。Ye等[29]发现分离于鹅盲肠的解淀粉芽胞杆菌S1产生的纤维素酶是一种天然纤维素酶，对热、酸具有明显抗性。解淀粉芽胞杆菌S1纤维素酶具有很强抗热和抗盐活性。Sun等[30]将该菌编码纤维素酶的基因克隆并在大肠埃希菌中表达。该基因全长1 500 bp，编码55 kD蛋白质。Irfan等[31]研究了分离于巴基斯坦克什米尔的塔塔帕尼温泉的解淀粉芽胞杆菌AK9，纯化于该菌株的纤维素酶在50～70 ℃宽泛温度内仍保留活性，在60 ℃和pH 5.0条件下稳定性最高；在存在非离子表面活性剂、不同金属离子和水不溶性有机溶液情况下，该酶也很稳定。可见，在理论和实际应用中，耐受性纤维素酶的研究都具有重要意义。

2.3 解淀粉芽胞杆菌产生的木聚糖酶

木聚糖水解酶系(Xylanolytic enzyme systems)是一类降解木聚糖的酶系。其中关键水解酶β-1,4-内切木聚糖酶能水解木聚糖分子中β-1,4-糖苷键，将木聚糖水解为小寡糖、木二糖等低聚木糖以及少量木糖和阿拉伯糖；而其中的β-木糖苷酶则水解低聚木糖末端，释放木糖残基。另外，参与彻底降解木聚糖的还有其他酶类，它们作用于木糖与侧链取代基之间的糖苷键，协同主链水解酶最终将木聚糖转化为单糖。Amore等[32]发现解淀粉芽胞杆菌XR44A能生产木聚糖酶，活力高达10.5 U/mL。通过酶谱法和蛋白组学组合分析，发现该酶属于β-1，4-内切木聚糖酶。在酒糟糖发酵期间，具有木聚糖酶活性的解淀粉芽胞杆菌培养液上清能产生约43%木糖。Liu等[33]在AOX1启动子控制下在毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115中高效表达了编码解淀粉芽胞杆菌木聚糖酶A (BaxA)基因BaxA，使用镍-亲和树脂柱层析将重组木聚糖酶(rePBaxA)纯化为同质。重组木聚糖酶rePBaxA是一种具有转糖基活力的内切木聚糖酶，可降解山毛榉木材和山毛榉木聚糖释放木糖-木六糖(X1-X6)混合物，其中木二糖(X2)和木三糖(X3)为主要产物。Kumar等[34]研究了解淀粉芽胞杆菌SK-3菌株木聚糖酶的特性，纯化的酶分子量为50 kDa。在不同酸性环境下仍保留很高活性，例如紫丁香酸 (无损失)、肉桂酸(97%保留)、苯甲酸(94%保留)和酚(97%保留)，该酶对酚醛塑料也表现良好耐受性。Xu 等[35]为了提高木聚糖酶特性以满足工业应用需要，通过易错PCR方法对编码解淀粉芽胞杆菌的木聚糖酶A的baxA基因进行突变，从基因文库中筛选到突变子pCbaxA50。序列比对揭示由pCbaxA50质粒产生的重组木聚糖酶内有一致突变位点S138T。纯化重组酶的比酶活为9.38 U/mg，比在大肠埃希菌 BL21(DE3)亲本菌株中表达的reBaxA高3.5倍。在热和极端的pH处理时reBaxA50比reBaxA更稳定。可见，通过定点突变方法可以获得更具耐受性的菌株，在实际生产中更具有应用价值。

3 解淀粉芽胞杆菌产生的与酯类代谢有关的酶

3.1 解淀粉芽胞杆菌产生的脂肪酶

脂肪酶(Lipase)属于羧基酯水解酶类，能逐步将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。脂肪酸广泛应用于食品、药品、皮革、日用化工等方面。Saengsanga等[36]从富含油脂的食物垃圾中分离到淀粉芽胞杆菌E1PA，该菌能产生一种需要植物油诱导的脂肪酶。该脂肪酶在异源大肠埃希菌宿主中被成功表达，纯化的脂肪酶氨基酸序列中108～112位具有保守五肽残基序ala-his-ser-met-gly。重组脂肪酶能水解多种酰基酯(C4-C18)，但以肉豆蔻酸对硝基苯基酯(C14)为最佳底物。该脂肪酶与已报导的B.amyloiquefaciens脂肪酶(脂肪酶亚家族I.4)结构相似；但同亚家族I.5(约43 kDa，pi 6)脂肪酶的结构差异显著。重组型和野生型脂肪酶E1PA均能以相似水平消化富含脂质的食物垃圾，在工业上可作为生产生物柴油的酶制剂。Kanmani等[37]在大肠埃希菌DH5α中克隆、表达和测序了解淀粉芽胞杆菌PS35脂肪酶基因。重组酶对长链帕拉胶-硝基苯酯(底物)具有偏爱性，因此具有典型脂肪酶特征。在不同化学调节剂存在时，酶表现出顽强的残余活性。有趣的是，有机溶剂(正己烷和甲苯)也有利于该酶活性的发挥，因此在工业应用更加理想[31]。生物柴油是典型的“绿色能源”，是由植物油、动物油、废弃油脂或微生物油脂与甲醇或乙醇经酯转化而形成的脂肪酸甲酯或乙酯。Cai等[38]使用富集培养方法从臭豆腐盐水中分离出解淀粉芽胞杆菌Nsic-8，经同源性分析获得该菌株脂类代谢关键酶基因，命名为lipBAi，推导出的脂肪酶氨基酸序列与解淀粉芽胞杆菌IT-45具有高度一致性，属于三酰甘油脂肪酶。使用质粒pET-28a在大肠埃希菌BL21(DE3)表达了该脂肪酶基因。重组酶LipBA在pH 7.0～11.0范围内稳定，但在碱性条件下更加稳定。以棕榈酸对硝基苯酯为底物，纯化的LipBA酶的Km和Vmax分别为(1.04±0.06) mmol/L 和(119.05±7.16)μmol/(mL·min)，可见继续研究和开发该重组酶将在生物柴油的生产上具有广阔前景。

3.2 解淀粉芽胞杆菌产生的酯酶

酯酶(Esterase)是一类催化酯键水解和合成的酶类。水解时催化酯键产生甘油和脂肪酸；合成时把酸的羧基与醇的羟基脱水缩合，产物为酯类及其他芳香类物质。解淀粉芽胞杆菌产生的酯酶(BAE)合成手性药物中间体(R)-1-(3′,4′亚甲二氧基苯基)乙酸乙酯。Liu等[39]通过蛋白质工程提高了BAE的区域选择性。获得的工程变株V10 (K358D/A396C) 具有极好的区域选择性，同时酶的活性并未因此改变。研究发现突变的酯酶BAE的区域选择性是因K358D 和A396C突变位点协作效应导致的结果。使用变种酯酶V10能很容易地制备区域纯度的(R)-1-(3′,4′-亚甲二氧基苯基)乙醇，ee值>97%。可见该工程化的酯酶在手性药物合成中具有应用潜力。Fengying等[40]研究了解淀粉芽胞杆菌产生的高化学和区域选择性脂酶产氯霉素酯的合成途径。使用克隆于解淀粉芽胞杆菌的酯酶LipBA将氯霉素和不同碳链长度的供体合成一系列氯霉素酯。可见，解淀粉芽胞杆菌酯酶的开发和利用有着广阔的前景。

4 解淀粉芽胞杆菌产生的漆酶、植酸酶及柚苷酶

4.1 解淀粉芽胞杆菌产生的漆酶

漆酶(Laccase)是一种含4个铜离子的多酚氧化酶(ρ-二元酚氧化酶，EC1.10.3.2)，属于单体糖蛋白形式存在的铜蓝氧化酶。漆酶发生反应后唯一产物就是水，本质上是一种环保型酵素。漆酶作为高效的生物检测器已成为底物、辅酶、抑制剂等分析的有效生物检测工具。一般真菌漆酶在pH 4.0以上时不能作用染料活性蓝52底物，并在>45 ℃下迅速失活。Nikola等[41]从塞尔维亚工农业土壤中分离出100株野生型芽胞杆菌，其中有3株菌株对ABTS显示了漆酶活性。在大肠埃希菌中对其中1株解淀粉芽胞杆12B漆酶基因进行了克隆，获得的重组漆酶甚至在pH 7.0和pH 4.0以及高温下也能降解染料活性蓝52。Chen等[42]对1株解淀粉芽胞杆菌漆酶基因在毕赤酵母中进行克隆和细胞外表达。重组漆酶能以高活性分泌于培养上清。尽管酶在610 nm处缺乏蓝色漆酶典型的吸收条带，但电子顺磁共振 (EPR)谱证明漆酶内部存在1型铜中心，这种结构在紫外和可见光谱中并未发现。金属含量分析揭示酶的每个蛋白质分子都包含2个铜离子、1个铁离子和1个锌离子，因此确定该酶是一种新的非蓝色漆酶。纯漆酶对底物额黑5和靛蓝具有高效脱色能力，在1 h后脱色率达93%。解淀粉芽胞杆菌重组漆酶优良特性使其在工业应用上比大多数漆酶可能更有优势。解淀粉芽胞杆菌漆酶比真菌漆酶在降解相关底物时更具优势，充分挖掘解淀粉芽胞杆菌的漆酶资源，将在工业和环境保护领域发挥更大的优势。

4.2 解淀粉芽胞杆菌产生的植酸酶

植酸酶(Phytases)能将磷酸残基从植酸上水解下来，破坏了植酸对矿物元素的亲和力，增加矿物元素营养效价，释放出的Ca2+可参与交联反应从而改变植物性食品质地，因此在食品加工业领域具有重要开发和应用价值。Ines等[43]对分离于突尼斯南部土壤的解淀粉芽胞杆菌US573植酸酶进行了纯化。该酶是依赖Ca2+并对胆汁具有良好稳定的酶(PHY US573)，最优pH和温度分别为7.5和70 ℃；在pH 4～10酶活稳定，在100 ℃和90 ℃下加热10 min，酶活性尚能保持50%和62%。该酶耐盐性极强，在20 g/L NaCl和LiCl盐浓度下，仍能保持80%和90%酶活力。该酶基因能编码383 aa寡肽，与Bacillussp.MD2 和B.amyloliquefaciensDS11 (3 和5 aa残基不同)热稳定性植酸酶一致率达99%，说明酶的热稳定性是由肽分子中同源性相似的氨基酸序列决定的。在含有盐和肌醇六磷酸的土壤中使用该植酸酶能提高耐盐性植物的磷利用效率。Xu等[44]为了增加植酸酶的活性，使用多重比和序列排布对不同来源微生物植酸酶结构进行了分析，在此基础上对解淀粉芽胞杆菌DSM 1061植酸酶表面(D148E、S197E 和N156E)和活性中心附近(D52E)的关键氨基酸残基位点进行了选择性定点突变。突变酶D148E和S197E在40～75 ℃范围内的比酶活分别比非突变酶增加35%和13%；kcat分别是野生酶的1.50和0.25倍。与野生酶相比，两种突变酶的热稳定性明显提高。可见，合理有效地利用解淀粉芽胞杆菌植酸酶的耐盐、耐热特点，将使植酸酶更好地应用于食品加工行业。

4.3 解淀粉芽胞杆菌产生的柚苷酶

柚苷酶(Naringinase)由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶组成，可以水解柚皮苷使果汁苦味减轻，是果汁脱苦的关键酶。柚苷酶具有将柚皮苷分解为普鲁宁、鼠李糖、葡萄糖和柚皮素等物质的功能，并且这些物质已广泛用于制药和饮料行业[45-46]。郦金龙等[47]利用前期筛选获得的1株解淀粉芽胞杆菌11568进行液体发酵产柚苷酶研究，考察不同碳源、氮源、pH值、培养温度、摇瓶转速、金属离子种类与浓度等对该菌株产柚苷酶能力的影响。通过单因素考察、响应面分析可知，解淀粉芽胞杆菌11568液体发酵产柚苷酶的最优培养基成分(g/L):麦芽糖15.1,胰蛋白胨10，(NH4)2HP0420，NaC1 10，酵母提取物5；最优发酵条件为培养温度40.9 ℃，摇床转速180 r/min，pH 7.5，发酵时间48 h。在最优条件下，柚苷酶活力达到201.12 U/mL，是优化前的2.4倍。Zhu等[48]对土壤解淀粉芽胞杆菌11568胞内柚苷酶进行了纯化、鉴定，并描述了其特征。使用SDS-PAGE电泳分子获得分子量为32 kDa的单一蛋白质条带。在45 ℃以下柚苷酶的最佳pH和温度分别为7.5和45 ℃；在pH 3.5～8.5范围内，酶能保持稳定；其Km和Vmax分别为 0.95 mmol/L和3 847.3 mmol/(L·min)。该酶能水解柚皮甙、新橙皮甙和其他苷类。柠檬汁中，当酶浓度达到4 U/mL时，能有效地去除柚皮苷，减轻果汁苦味。可见，解淀粉芽胞杆菌的柚苷酶的研究也有很重要的价值，继续开发解淀粉芽胞杆菌的柚苷酶，在药品和饮料行业中必然会获得更大的经济效益。

5 展 望

解淀粉芽胞杆菌是芽胞杆菌属的一个种，在生长过程中产生了十分丰富的酶系，包括分解多糖、蛋白质和脂肪等的水解酶类，也包括其他重要酶类，如酯酶、溶栓酶、漆酶、植酸酶和柚苷酶等。该种杆菌对细菌、植物病原真菌甚至病毒均具有很强抗性，其中一些酶，例如几丁质酶、β-1，3葡聚糖酶本身就具有抗菌活性，其次级代谢产物的合成是与其特殊的基因组序列紧密相关，通过基因的表达，产生丰富的酶系。因此，解淀粉芽胞杆菌的优势与其产生的丰富代谢酶系直接相关。随着全基因组测序数据的不断积累和解析，其种类丰富的酶系基因功能将会被人们更多地认识，这必将促进其在各领域的应用，解淀粉芽胞杆菌高效、环保、无残留的特点决定了其应用空间的可塑性。随着基因工程的发展，有针对性地构建其优良工程菌株，使用定点突变对菌株产酶特性加以优化改造，利用基因组、转录组和蛋白质组学有目的地研究各种酶催化机制，将使其应用空间变得更加广阔，最终带来巨大的社会效益和生态效益。