阿奇霉素片微生物限度检查方法的适用性验证

瞿燕萍

摘 要 目的：建立大环内酯类抗生素药物阿奇霉素片微生物限度检查方法并对其进行验证。方法：参照2015年版《中国药典》四部通则，采用薄膜过滤法测定阿奇霉素片对金黄色葡萄球菌等5种试验菌种的回收率，并对其进行了控制菌适用性试验。结果：5种试验菌回收率均在0.5～2.0范围，控制菌可检出。结论：本试验所建立方法可用于阿奇霉素片的微生物限度檢查。

关键词 阿奇霉素 验证 微生物限度试验

中图分类号：R927.11 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2019）23-0107-04

Applicability validation for the microbial limit test of azithromycin tablets

QU Yanping*

（Shanghai Shyndec Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200137， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the microbial limit test of azithromycin tablets and to verify it. Methods： According to the fourth part of the 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia principles， the recovery rates of azithromycin tablets to 5 kinds of test microorganisms including Staphylococcus aureus， Pseudomonas aeruginosa， Bacillus subtilis， Candida albicans and Aspergillus niger were determined by membrane filtration and Petri dish cultivation， and the applicability test of Escherichia coli as the control bacterium was also performed. Results： The recoveries of the five tested bacteria ranged from 0.5 to 2.0， and the control bacteria could be detected. Conclusion： The established method can be used for microbial limit test of azithromycin tablets.

KEy WORDS azithromycin； verification； microbial limit test

阿奇霉素（azithromycin）是第一个十五元环大环内酯类抗生素（macrolide），也是第一个氮杂内酯类抗生素（azalide）[1]。其对革兰阳性菌及厌氧菌有较好的抗菌作用外，对革兰阴性菌中的流感嗜血杆菌、淋病奈瑟球菌有很强的抗菌作用[2]。大环内酯类抗生素为快效抑菌剂，广泛应用于临床，近些年来，大环内酯类抗生素的发展较快，尤其是其长效品种的出现，更给该类药物的临床应用带来了活力[3]。上海现代制药股份有限公司自2007年2月生产销售阿奇霉素片至今，在销售市场占有一定份额，由于《中国药典》2015年版摒弃了离心处理获得供试液，需通过其他处理获得供试液，供试液中抑菌作用的分散浓度也将直接影响验证的回收率，故需对该产品重新进行微生物限度检查方法的适用性验证，同时对其他大环内酯类抗生素无微生物限度检查法的建立具有一定的借鉴意义[4]。阿奇霉素片微生物限度检查包括需氧菌、霉菌和酵母，控制菌选取大肠埃希菌。对具有抗菌活性的药品进行微生物限度检查时，应首先消除其抗菌活性，并通过实验验证抗菌活性的去除是否彻底，以保证检验结果的有效性，薄膜过滤法是去除药品中抗菌成分的最有效方法[5]。同时加入适宜的中和剂也能起到有效降低抑菌性的作用。为保障患者的用药安全，确立可靠的微生物限度检验方法，本试验参照2015年版《中国药典》四部通则1105、1106非无菌产品微生物限度检查微生物计数法、控制菌检查法，对阿奇霉素片微生物限度检查方法进行了摸索与验证[6]，由于阿奇霉素在同类的大环内酯类抗生素中其抑菌性的强度偏中上，故在验证中发现需通过提高供试品溶液的稀释倍数，在样品溶解时加入适宜的中和剂（卵磷脂与吐温-80）[6]，并在薄膜过滤冲洗液中加入吐温-80作为增溶剂等方法相结合，可有效去除大环内酯类抗生素的抑菌作用。

1 材料和方法

1.1 药品与试剂

阿奇霉素片（上海现代制药股份有限公司，规格0.25 g，批号180304）。

pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液（上海盛思生化科技有限公司，批号170801）；蛋黄卵磷脂（博飞美科试剂公司，批号18032）；吐温-80（国药集团化学试剂有限公司，批号20131016）。

1.2 培养基与菌种

胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）、麦康凯琼脂培养基、麦康凯液体培养基（上海盛思生化科技有限公司，批号分别为170801、171109、180103、161201、160701）。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， CMCC（B） 26003）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，CMCC（B）10104）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis，CMCC（B）-63501）、白色假丝酵母（Candida albicans，CMCC（F）-98001）、黑曲霉（Aspergillus niger，CMCC（F）-98003）和大肠埃希菌（Escherichia coli，CMCC（B）44102）均来自于中国食品药品检定研究院。

1.3 实验仪器

LRH-150生化培养箱、GNP-9160隔水式恒温培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；S20 pH酸度计（梅特勒托利多仪器（上海）有限公司）； HT-600N电子天平（成都普瑞逊电子有限公司）；YXQ-LS-75SⅡ立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备廠）；1300 SERIES A2生物安全柜（赛默飞世尔科技公司）；YX940D电动吸引器（上海医疗器械公司医用吸引器厂）；JYD-400N均质器（上海之信仪器有限公司）；微孔滤膜（上海兴亚净化材料厂，规格50 mm，孔径0.45 mm）。

1.4 实验方法

参照2015年版《中国药典》四部通则[5]对阿奇霉素片进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌检查方法的确认，所有试验均采用薄膜过滤法。

1.4.1 菌液的制备

参照2015年版《中国药典》四部通则[5]1105微生物计数法项下方法制备。

将阳性菌菌液稀释10-3～10-7倍，使菌落数不大于

100 cfu/ml。

1.4.2 供试液的制备

取阿奇霉素片10 g，粉碎，移至一次性无菌袋中，加入pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（内含0.3%卵磷脂与3%吐温80）100 ml中，用拍打器拍打1 min（拍打速率12下/min），即得阿奇霉素供试液Ⅰ（100 mg/ml）；用pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释，分别配制成供试液Ⅱ（50 mg/ml）、供试液Ⅲ（20 mg/ml）、供试液Ⅳ（10 mg/ml）、供试液Ⅴ（5 mg/ml）。

1.4.3 计算公式及接受标准

试验组比值=（试验组菌落数-供试品对照组菌落数）/菌液对照组菌落数。

所得比值均应在0.5～2.0范围内。

1.4.4 微生物总数计数方法

1）需氧菌计数方法的确定（预试验） 以金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌和铜绿假单胞菌为试验菌，分别对供试品进行处理。①分别取供试液Ⅱ与Ⅲ各1 ml，用pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液1 000 ml薄膜过滤冲洗；②取供试液Ⅳ1 ml，采用pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液（内含0.1%吐温80）1 000 ml薄膜过滤冲洗；③分别取供试液Ⅳ与Ⅴ各1 ml，采用pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液（内含0.1%吐温80）1 000 ml薄膜过滤冲洗（最后冲洗100 ml时加入菌悬液）。

2）霉菌和酵母菌计数方法的确定（预试验） 以白色假丝酵母和黑曲霉菌为试验菌，分别采用2种方法对供试品进行处理。①取供试液Ⅰ1 ml平皿法测定；②取供试液Ⅰ1 ml，采用pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液（内含0.1%吐温80）1 000 ml薄膜过滤冲洗（最后冲洗100 ml时加入菌悬液）。

1.4.5 微生物计数验方法证

经过预试验，确认需氧菌计数使用方法③，霉菌和酵母菌计数使用方法②。根据此结论进行三次平行实验确认。①试验组：取供试液Ⅴ1 ml，移至pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（内含0.1%吐温80）100 ml中，混匀，过滤，然后用冲洗液冲洗9次，每次100 ml，最后冲洗100 ml时加入1 ml菌液（<100 cfu/ml），滤干，将膜的正面贴于胰酪大豆胨琼脂（TSA）培养基平板，于30～35 ℃培养3～5 d；霉菌和酵母菌同法操作，将膜的正面贴于沙氏葡萄糖琼脂（SDA）培养基平板，于20～25 ℃培养5～7 d。②供试品对照组：不加入菌液的供试液，测定供试品微生物数；③菌液对照组；取稀释液替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行回收试验。

1.4.6 控制菌验证试验

以大肠埃希菌作为控制菌采用薄膜过滤法进行操作。①试验组：取供试液Ⅳ100 ml，采用pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液1 000 ml薄膜过滤冲洗，取滤膜置100 ml TSB中，混匀，同时加入大肠埃希菌菌悬液1 ml混合均匀；②阴性对照组：取pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液1 000 ml薄膜过滤冲洗后的滤膜置TSB 100 ml中；③菌液组：取TSB 100 ml加入大肠埃希菌菌悬液1 ml混合均匀。均按药典方法培养，以接入试验组的大肠埃希菌被检出为接受标准。

2 结果

2.1 需氧菌总数计数方法的预实验

5种预实验结果表明，方法③可用于需氧菌总数的计数（表1）。

2.2 氧菌总数计数方法验证

按照方法③对一批供试品进行平行三次验证试验，结果表明方法③可用于阿奇霉素片需氧菌总数计数（表2）。

2.3 真菌总数的预实验

两种预实验方法试验结果表明，方法②可用于霉菌和酵母菌总数的计数（表3）。

2.4 真菌总数方法验证

按照方法②对一批供试品进行平行三次验证试验，结果表明采用方法②可用于阿奇霉素片霉菌和酵母菌总数计数（表4）。

2.5 控制菌验证试验

控制菌选用稀释10-6倍的大肠埃希菌，一批供试品进行平行三次验证，结果为试验组和阳性组均检出大肠埃希菌生长，而阴性组均未检出，表明适用性试验符合药典标准。

3 讨论

通过上述一系列试验，成功摸索出了适合阿奇霉素片的微生物限度控制方法，由于本次验证中通过拍打器拍打样品获得供试液，拍打器处理使产品的抑菌成分更好的分散开来，除了通过中和剂与薄膜过滤的联用起到抑菌作用外，在稀释液内增加吐温80与验证中菌液的加入时间也会提高验证回收率，但需注意：一是由于冲洗液内含有0.1%吐温80，故在进行薄膜过滤时滤膜尽量抽滤充分后进行培养，防止菌落出现连片现象，从而影响计数观察；二是由于产品的抑菌性较强，故试验用菌悬液需在薄膜过滤中最后冲洗100 ml时加入。

抗菌药物含有较强的抑菌成分，使用正确的方法消除其抑菌成分，提高微生物的检出率是至关重要的[7]。检查方法中干扰因素较多，易影响计数结果，如培养条件、培养基、加菌浓度及加菌量等[8-9]。药品微生物计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（MPN法），供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法应尽量选择微生物培养中操作简便、快速的方法，对于抑菌作用较强的供试品，应尽量选用薄膜过滤法进行试验[6]。本次验证中阿奇霉素片是大环内酯类抗生素药物，具有较强的抑菌性，通过各种处理，确定消除药品的抑菌性后再进行微生物限度检查是检验方法筛选的基本原则[10]，同时在预实验过程中发现，薄膜过滤冲洗液内添加0.1%的吐温80可起到增溶作用，使用适宜的中和剂也可有效降低产品的抑菌效果，并在适用性试验时对供试液进行更高倍数的稀释[5]，故在本次验证中通过提高稀释倍数+中和剂+薄膜过滤来进行验证。

参考文献

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