复合酶膜生物传感器差分法检测牛乳中乳糖的含量

杜祎，张金玲，朱思荣，张利群，赵晓华，史建国，毕春元

(齐鲁工业大学(山东省科学院)山东省科学院生物研究所 山东省生物传感器重点实验室，山东 济南 250014)

乳糖是牛乳中特有的一种双糖，并且其在牛乳中的含量是相对稳定的[1]。乳糖不仅可以促进钙离子的吸收，还可以促进有益菌的生长，有利于肠道健康。但是有些人体内缺少乳糖酶，食用过量的乳糖会出现腹泻、腹痛等症状，因此建立一种简单、快速的检测方法是十分重要的[2-3]。目前国标中规定乳糖的检测方法有高效液相色谱法和莱因-埃农氏法。高效液相色谱法[4-7]虽然结果准确，但成本高，操作繁琐；莱因-埃农氏法终点不易判断，容易引起系统误差[8-11]。

本研究建立了一种快速检测乳糖的方法——复合膜生物传感器差分法。采用酶固定化技术，将半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶固定于载体膜上形成复合膜，并安装在一个电极上，另外一个电极上安装葡萄糖酶膜，两个酶膜发生反应的最终产物过氧化氢通过过氧化氢电极检测，经过差分处理，测定乳糖的含量。这样不仅可排除本底葡萄糖测定的干扰，还可以同时检测葡萄糖和乳糖的含量。此方法快速准确，易于操作，专一性强。

1 材料与仪器

葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶(Sigma公司)；牛血清蛋白、戊二醛(上海化学试剂采购供应站进口分装)；乳糖(Sigma公司)；“O”型空圈、SBA缓冲液(山东省科学院生物研究所)；核微孔膜(美国Nucleopore公司)；其他试剂均为分析纯，所用水为蒸馏水。

SBA-40D型生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所)；50 μL微量进样(上海光正医疗仪器有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；分析天平(德国赛多利斯集团)。

2 实验方法

2.1 乳糖-葡萄糖复合膜及葡萄糖氧化酶膜的制备

首先将“O”型圈粘在核微孔膜上制成载体膜，置于30%甲醇溶液中浸泡30 min后用蒸馏水冲洗，在烘箱中烘干，取出备用。以5.0%戊二醛为交联剂分别将葡萄糖氧化酶和半乳糖苷酶-葡萄糖氧化酶固定在载体膜上，在40 ℃烘箱中烘20 min，取出放在4 ℃冰箱中备用。

2.2 测定原理

H2O2→O2+2H++2e-

乳糖通过半乳糖苷酶分解成半乳糖和葡萄糖，葡萄糖再被葡萄糖氧化酶分解成葡萄糖酸，产生过氧化氢，通过过氧化氢电极产生电信号，再通过SBA-40D型生物传感分析仪将电信号转化成直接读取的数字信号，通过差分处理，即可准确快速地直接测定乳糖的含量。

2.3 乳糖-葡萄糖标准液的配制

取适量乳糖和葡萄糖标准品放入称量瓶中，于104 ℃烘干箱内烘4 h，然后在干燥器内冷却，待冷却完全后，准确称取1.500 0 g乳糖、1.000 0 g葡萄糖，用蒸馏水溶解后转移至1 L容量瓶中，定容备用。

2.4 样品测定

采用0.2 mol/L磷酸盐缓冲液体系，在SBA-40D生物传感分析仪上分别安装乳糖酶膜和葡萄糖酶膜，接通电源，采用差分法，当仪器显示基础定标时，用微量进样针准确吸取25 μL葡萄糖标准液注入反应池内，重复此操作直至出现定标通过。接着当仪器显示“差值定标，请进样品”字样时，取25 μL乳糖标准液注入反应池内，同样重复此操作直至定标通过，接下来就可以检测样液中乳糖的含量。采用差分法可以自动减去样品中葡萄糖的含量，从而屏幕中直接显示乳糖和葡萄糖的含量。

2.5 生物传感器法测定乳糖的最适pH

本研究采用的磷酸盐缓冲液体系，分别配制pH 为4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0的缓冲剂，研究不同pH对乳糖测定体系的影响。

2.6 线性实验

分别配制浓度为0.30 ，0.60，0.90 ，1.20 ，1.50 g/L的乳糖标准液和浓度为0.20，0.40 ，0.60 ，0.80 ，1.00 g/L的葡萄糖标准液，每个浓度重复测定3次，计算生物传感器法测定乳糖和葡萄糖的线性。

2.7 乳糖和葡萄糖混合液对乳糖电极和葡萄糖电极测定的干扰性

对乳糖和葡萄糖混合液进行测定，在1.50 g/L乳糖溶液中分别添加浓度为0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 g/L的葡萄糖。在1.0 g/L葡萄糖溶液中分别添加浓度为0.30，0.60，0.90，1.20，1.50 g/L的乳糖，分别测定乳糖和葡萄糖的含量。

2.8 生物传感器法对乳糖测定的稳定性

对1.50 g/L乳糖标准液连续测定10次，并计算生物传感器法测定乳糖的精密度。

2.9 生物传感器法测定乳糖的回收率

先测定5个不同浓度的乳糖样品，然后依次添加同体积的浓度为0.50，0.40，0.30，0.20，0.10 g/L的乳糖标液，计算生物传感器法测定乳糖的加标回收率。

2.10 不同方法测定牛乳中乳糖含量的对比

采用生物传感器法和高效液相色谱法(HPLC)分别对超市中出售的两种名牌牛奶中的乳糖进行测定，对测定结果进行对比。

2.11 生物传感器法测定乳糖专一性检测

分别对浓度为1.5 g/L的乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉标准液，用生物传感器法进行测定，检测生物传感器法测定乳糖的专一性。

3 结果与分析

3.1 生物传感器法测定乳糖的最适pH

在此测定体系中，乳糖酶膜是半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶这两种酶组成的复合酶膜，而葡萄糖氧化酶最适pH为5.0左右，半乳糖苷酶最适pH为6.6左右，故需要找到复合酶膜的最适pH。研究pH为4.5～8.0时，缓冲剂对乳糖酶膜的影响，结果如图1所示。

图1 pH对乳糖电极响应值的影响

由图1的结果可以看出，pH在4.5～7.0内，酶电极的响应值随着pH的升高而增强，在pH=7.0时达到最大值，后随着pH的升高而减少，故选择缓冲剂的pH为7.0。

3.2 线性实验

分别配制浓度为0.30，0.60，0.90，1.20，1.50 g/L的乳糖标准液和浓度为0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 g/L的葡萄糖标准液，每个浓度重复测定3次，分别以乳糖标准液和葡萄糖标准液质量浓度为横坐标x，以电极的响应值为纵坐标y，绘制标准曲线，结果如图2所示。

图2 乳糖电极对单一乳糖和葡萄糖的响应

由图2可见，乳糖在0.00～1.50 g/L，葡萄糖在0.00～1.00 g/L内具有良好的线性关系。乳糖的线性关系为y=98.85 7x+2.190 5，r2=0.999 3，葡萄糖的线性关系为y=99.714x+0.809 5，r2=0.999 5。

3.3 乳糖和葡萄糖混合液对乳糖电极和葡萄糖电极测定的干扰性

对乳糖和葡萄糖混合液进行测定，在1.50 g/L乳糖溶液中分别添加浓度为0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 g/L的葡萄糖溶液，在1.0 g/L葡萄糖溶液中分别添加浓度为0.30，0.60，0.90，1.20，1.50 g/L的乳糖，分别测定乳糖和葡萄糖的含量，结果见表1。

表1 乳糖和葡萄糖混合液对乳糖电极和葡萄糖电极的响应

由表1结果可以看出，含有乳糖和葡萄糖的混合溶液，不管是乳糖的测定还是葡萄糖的测定，都具有较强线性关系，并且在葡萄糖浓度不同时，同一浓度的乳糖测定的变异系数是0.87%，乳糖浓度不同时同一浓度的葡萄糖测定的变异系数是1.13%，说明葡萄糖和乳糖的测定互不干扰。

3.4 生物传感器法乳糖测定的稳定性

当仪器定标通过后，对乳糖标准液(1.50 g/L)连续测定10次，测定结果如表2所示。

表2 生物传感器法测定乳糖浓度

由表2可以得出，生物传感器法测定乳糖的精密度为1.49%，说明该方法的稳定性良好。

3.5 生物传感器法测定乳糖的回收率

先测定5个不同浓度的乳糖样品，然后依次添加同体积的浓度为0.50，0.40，0.30，0.20，0.10 g/L的乳糖标液，计算生物传感器法测定乳糖的加标回收率。结果如表3所示。由表3可以得出，生物传感器法测定乳糖含量的加标回收率为95%～105%。

表3 生物传感器法测定乳糖含量的加标回收率

3.6 不同方法测定牛乳中乳糖含量的对比

采用生物传感器法和HPLC法对超市中出售的两种品牌牛奶中的乳糖进行测定，对测定的结果进行比较，结果如表4所示。

表4 生物传感器法和高效液相色谱法对乳糖含量测定结果的比较

由表4可以看出，生物传感器法平均值及相对标准偏差稍大于HPLC法，但差异不明显(P>0.05)，两种方法具有良好的一致性。

3.7 生物传感器法测定乳糖专一性检测

分别对浓度为1.50 g/L的乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉标准液用生物传感器法进行测定，测定结果如表5所示。

表5 生物传感器法测定乳糖的专一性测定结果

由表5测定的数据可以得出，除了乳糖之外，其他的糖类基本无明显响应，因此生物传感器测定乳糖含量的方法专一性很高。

4 结论

本研究制备了乳糖-葡萄糖复合酶膜，建立了复合膜生物传感器差分法检测牛奶中乳糖的方法，并研究了该方法的最适pH、线性范围、稳定性、干扰性和回收率等。结果表明，该方法的操作简单、稳定性好、线性良好、专一性强、回收率高，与高效液相色谱法的结果进行比较，具有良好的一致性，复合膜生物传感器差分法测定牛乳中乳糖的含量具有可行性。