黑曲霉葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的表达及其高效发酵研究

卢 洋，张帅兵，翟焕趁，李 娜，吕扬勇，胡元森，蔡静平

河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001

葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)是一类能催化β-D-葡萄糖和氧气生成葡萄糖酸-δ-内酯和过氧化氢的酶类[1]。目前，已发现曲霉、青霉和芽孢杆菌等多种微生物可产生葡萄糖氧化酶，用于研究和实际应用最多的是来源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶，该酶在面粉和饲料添加剂、葡萄糖酸及其盐生产以及生物传感器等方面具有广泛的应用前景[2-7]。研究表明通过向小麦粉中添加葡萄糖氧化酶可改善面团品质、发酵稳定性和面包体积等[3,8-9]。葡萄糖氧化酶在饲料中添加可促进动物消化吸收、保护肠道和提高动物免疫力等，是替代抗生素具有较好前景的新型饲料酶制剂[10-12]。近年来，市场上对葡萄糖氧化酶的需求日益增加，高效发酵制备葡萄糖氧化酶可降低其生产成本。在黑曲霉发酵葡萄糖氧化酶的生产工艺中，发酵成本较高、酶制剂分离纯化较复杂，而利用基因工程菌高效发酵黑曲霉葡萄糖氧化酶可有效降低生产成本。

作者通过将黑曲霉葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中组成型表达，纯化得到了葡萄糖氧化酶并分析了其酶学特性。为了进一步提高其发酵效率，将黑曲霉葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中进行诱导型表达并利用G418抗生素筛选获得了毕赤酵母高效表达菌株，通过高密度发酵可高效发酵黑曲霉葡萄糖氧化酶。本研究为高效发酵黑曲霉葡萄糖氧化酶及进一步改造其酶学特性奠定了试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

E.coliDH5α、PichiapastorisX-33、黑曲霉菌株、pGAPZαA和pPIC9K质粒载体：河南工业大学生物工程学院实验室保藏。T4 DNA连接酶、EcoR I限制性内切酶、NotI限制性内切酶、糖苷内切酶H (Endo H)：美国New England Biolabs公司；pMD18-T载体、Taq DNA聚合酶：宝生物工程(大连)有限公司(Takara)；镍离子亲和树脂：美国伯乐公司；双色预染蛋白Marker(货号C610011)、真菌总RNA快速抽提试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、Bradford蛋白浓度测定试剂盒：上海生工生物有限公司。

LB培养基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L；Low-salt LB培养基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L；YPD培养基：酵母粉10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L；YPDS培养基：酵母粉10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，山梨醇182 g/L；BMGY培养基：酵母粉10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，YNB 13.4 g/L，甘油10 g/L，生物素4×10-4g/L，0.1 mol/L K2HPO4/KH2PO4缓冲液(pH 6.0)；BMMY培养基：酵母粉10 g/L，胰蛋白 20 g/L，YNB 13.4 g/L，甲醇10 g/L，生物素4×10-4g/L，0.1 mol/L K2HPO4/KH2PO4缓冲液(pH 6.0)。

1.2 仪器与设备

TS-200B恒温摇床：上海天呈试验仪器制造有限公司；SHP-150型恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；A200PCR仪：杭州朗基科学仪器有限公司； BG-subMIDI水平电泳仪、BG-verMIDI垂直电泳仪：北京百晶生物技术有限公司；Gel Doc XR+凝胶成像系统、MicroPulser电穿孔仪：美国伯乐公司；JY92-Ⅱ超声波细胞破碎仪：宁波新芝生物科技股份有限公司；小型切向流超滤系统(Labscale TFF System)：美国密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 黑曲霉葡萄糖氧化酶编码序列的克隆

将活化后的黑曲霉孢子接种于察氏培养基中，于200 r/min、28 ℃条件下培养5 d后用无菌纱布过滤菌丝体。液氮快速冷冻菌丝体并在研钵中快速研磨后，利用真菌总RNA快速抽提试剂盒提取黑曲霉总RNA。按照反转录PCR试剂盒说明书，以总RNA为模板、oligo(dT)为引物反转录出cDNA。然后，根据NCBI数据库中已报道的黑曲霉葡萄糖氧化酶编码序列信息(GenBank: FJ979866.1)设计正向引物Gox-F：5′- ATGCAGACTCTCCTTGTG -3′和Gox-R：5′- TCACTGCATGGAAGCATAATC -3′，利用Taq DNA聚合酶以cDNA为模板PCR扩增出葡萄糖氧化酶编码序列。利用DNA胶回收试剂盒获得黑曲霉葡萄糖氧化酶编码序列，利用T4 DNA将其与pMD18-T载体连接后转化大肠杆菌并测序验证。利用信号肽分析在线软件SignalP-5.0 (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和PrediSi (www.predisi.de/)分析黑曲霉葡萄糖氧化酶的信号肽[13-14]。

1.3.2 黑曲霉葡萄糖氧化酶表达载体的构建

设计正向引物mGox-F：5′- taggaggt gaattc AGCAATGGCATCGAAGCCAG -3′ 和mGox-R：5′ -taggaggt gcggccgc TCACTGCATGGAAGCATAATC -3′，以测序验证正确的质粒模板PCR扩增不含信号肽的葡萄糖氧化酶编码序列，PCR反应条件：95 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，2 min；反应30个循环，最后72 ℃延伸反应10 min。利用DNA胶回收试剂盒获得目的基因后，用EcoR I和NotI限制性内切酶对目的基因进行酶切。然后，用T4 DNA连接酶将其与用同样的限制性内切酶处理的pPIC9K质粒相连接，并转化E.coliDH5α后测序验证，将此重组质粒命名为pPIC9K-mGOX。

1.3.3 黑曲霉葡萄糖氧化酶编码序列在毕赤酵母中的转化与表达

用BspH I限制性内切酶对重组质粒pGAPZαA-mGOX进行酶切反应，制备线性化的重组质粒片段。制备毕赤酵母感受态细胞，利用电穿孔仪，将线性化重组质粒片段转入毕赤酵母感受态细胞后涂布含有100 μg/mL博来霉素的YPDS固体培养基上。于28 ℃培养箱中放置3 d，挑取单菌落并接种于100 mL YPD液体培养基中,28 ℃恒温摇床中培养2 d。离心收集发酵上清液，通过酶活检测分析葡萄糖氧化酶的表达。

1.3.4 黑曲霉葡萄糖氧化酶活性测定方法

黑曲霉葡萄糖氧化酶活性的测定参照Tu等[15]的方法并稍加修改。反应体系:10 mmol/L葡萄糖0.78 mL、2 000 U/mL辣根过氧化物酶40 μL、20 mmol/L愈创木酚的pH 6.0磷酸钠缓冲液0.78 mL。取0.4 mL葡萄糖氧化酶酶液加入1.6 mL反应溶液中，于35 ℃水浴锅反应5 min后，利用分光光度计在470 nm波长处测定吸光度。取0.4 mL不同浓度的过氧化氢加入1.6 mL反应溶液中进行反应，根据葡萄糖浓度和470 nm波长处吸光度绘制标准曲线。通过标准曲线计算酶液中葡萄糖氧化酶的酶活。酶活定义：在35 ℃、pH 6.0条件下，每1 min内催化生成1 μmol的过氧化氢的酶量为1个酶活单位。

1.3.5 黑曲霉葡萄糖氧化酶的纯化和酶学性质分析

利用labscale小型切向流超滤系统(Labscale TFF System)对发酵上清液进行浓缩，根据镍离子亲和层析操作手册(Ni-NTA Superflow Cartridge Handbook)的操作方法，利用镍离子亲和层析树脂纯化葡萄糖氧化酶。通过4%浓缩胶和12%分离胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳对浓缩和纯化后的葡萄糖氧化酶进行SDS-PAGE分析。按照说明书，在37 ℃下用500 U的糖苷内切酶H (Endo H)处理纯化后的葡萄糖氧化酶以分析其糖基化。利用Bradford蛋白浓度测定试剂盒检测纯化后葡萄糖氧化酶的浓度。采用上述酶活检测反应条件对纯化后的葡萄糖氧化酶的比活力进行分析，比活力为在35 ℃、pH 6.0条件下每毫克葡萄糖氧化酶所具有的酶活单位数。根据葡萄糖氧化酶在35 ℃、100 mmol/L乙酸钠缓冲液(pH 3.0～5.0)、磷酸盐缓冲液(pH 6.0～8.0)和Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)条件下的反应活性确定其最适反应pH值；将葡萄糖氧化酶在pH 3.0～9.0条件下温育1 h后，于pH 6.0、35 ℃条件下测定残余酶活以确定其pH稳定性。根据葡萄糖氧化酶在pH 6.0、25～65 ℃条件下的反应活性确定其最适反应温度；将葡萄糖氧化酶在25～65 ℃水浴中处理1 h后，于pH 6.0、35 ℃条件下测定残余酶活以确定其热稳定性。

1.3.6 黑曲霉葡萄糖氧化酶多拷贝表达菌株的构建及筛选

参照毕赤酵母表达手册(Revision A.0, MAN0000012, Invitrogen)构建和筛选黑曲霉葡萄糖氧化酶多拷贝表达的毕赤酵母菌株。利用PmeI限制性内切酶线性化重组质粒pPIC9K-GOX后转化毕赤酵母GS115菌株。将其涂布于MD固体培养基上30 ℃培养2 d后，在MD培养基上加无菌水并用涂布棒刮下菌体制成约1×106cfu/mL的菌悬液。吸取100 μL菌悬液涂布于分别含有1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL G418抗生素的YPD固体培养基平板上，于30 ℃培养箱中培养3 d。

1.3.7 毕赤酵母高效发酵葡萄糖氧化酶的条件分析

参照毕赤酵母发酵工艺手册(Version B, 053002, Invitrogen),对毕赤酵母高效发酵葡萄糖氧化酶的条件进行分析。挑取含有4 mg/mL G418抗生素的YPD固体培养基平板上生长出的单菌落接种于BMGY培养基中,30 ℃、220 r/min培养2 d后离心收集菌体，用BMMY重悬菌体至湿菌体浓度为200 g/L。将50 mL湿菌体浓度为200 g/L的菌悬液分别移入250 mL无菌摇瓶中并于30 ℃、220 r/min条件下高密度培养。每天加入1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的甲醇，分析甲醇添加量对葡萄糖氧化酶表达量的影响；分析在最优甲醇添加量条件下发酵时间对葡萄糖氧化酶表达量的影响。采用上述酶活检测反应体系，在35 ℃、pH 6.0条件下分析发酵上清液中葡萄糖氧化酶的活力。利用Bradford蛋白浓度测定试剂盒检测纯化后葡萄糖氧化酶的浓度。

2 结果与讨论

2.1 黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的克隆与表达

以黑曲霉总RNA为模板，扩增出了葡萄糖氧化酶的编码基因。该基因长度为1 818 bp(含1个终止密码子)，编码605个氨基酸，与已报道来源于黑曲霉Z-25菌株的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列一致性为100%[16]。利用SignalP-5.0和PrediSi在线软件分析，黑曲霉葡萄糖氧化酶具有21个氨基酸组成的信号肽，推测其分子质量为63.1 kDa。为了表达具有催化活性的葡萄糖氧化酶，利用PCR技术获得去除信号肽的成熟葡萄糖氧化酶编码序列。将该编码和pGAPZαA质粒载体重组并转化毕赤酵母X-33菌株后，挑取单菌落接种于YPD液体培养基中进行蛋白表达。结果表明黑曲霉葡萄糖氧化酶可在毕赤酵母中组成型表达，发酵上清液中葡萄糖氧化酶的酶活可达1.2 U/mL。

2.2 黑曲霉葡萄糖氧化酶的纯化

通过对发酵上清液浓缩并利用镍离子亲和层析对浓缩后发酵液中的葡萄糖氧化酶进行分离纯化，发酵液中葡萄糖氧化酶酶活可回收81.38%(表1)。黑曲霉葡萄糖氧化酶的SDS-PAGE分析见图1，纯化后得到了分子质量约为100 kDa的葡萄糖氧化酶，分子质量与推测的分子质量相比偏大，这可能与该蛋白在毕赤酵母中表达的糖基化有关。利用糖苷内切酶H(Endo H)去除葡萄糖氧化酶的糖基化后，其分子质量约为70 kDa，与推测的分子质量相近。

表1 葡萄糖氧化酶纯化后酶活回收率

注：泳道1为蛋白质Marker；泳道2为浓缩后发酵上清液；泳道3为纯化后的葡萄糖氧化酶；泳道4为糖苷内切酶H处理后的葡萄糖氧化酶。

2.3 葡萄糖氧化酶酶学性质

对纯化后的葡萄糖氧化酶的酶学性质进行研究，结果见图2和图3，在当前反应条件下该酶的比活力为60.9 U/mg。该酶的最适反应pH为6，其在pH 5～8条件下具有较好的稳定性。葡萄糖氧化酶的最适反应温度为35 ℃，将葡萄糖氧化酶在45 ℃条件下温育1 h后测定其残余活力仍保留80%以上。

图2 葡萄糖氧化酶的最适反应pH和pH稳定性分析

图3 葡萄糖氧化酶的最适反应温度和热稳定性分析

2.4 葡萄糖氧化酶高效表达菌株的筛选及发酵条件分析

为了进一步提高葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的表达量，将葡萄糖氧化酶编码序列与pPIC9K载体重组后转化毕赤酵母GS115菌株得到了诱导型表达的工程菌株。通过G418抗生素筛选，得到了可在含有4.0 mg/mL G418的培养基上生长的菌株(图4)。对该菌进行高密度发酵条件研究表明：该菌株发酵葡萄糖氧化酶的最优甲醇添加量为2.5%(图5)。在甲醇添加量2.5%的诱导发酵过程中，葡糖糖氧化酶的表达量和酶活呈不断上升趋势，至第7天时葡萄糖氧化酶发酵量可达133 U/mL(图5)，蛋白表达量约1.9 g/L(图6)。发酵7 d后，上清液中酶活不再增加，蛋白浓度增加可能是由于酵母菌部分自溶引起的。

注：a、b、c、d分别为G418质量浓度1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL。

图5 甲醇添加量对发酵液中葡萄糖氧化酶酶活的影响

注：泳道M为蛋白质Marker，泳道1—7分别为甲醇诱导后第1—7天的发酵上清液。

2.5 讨论

黑曲霉葡萄糖氧化酶在面粉和饲料添加剂、葡萄糖酸及其盐生产和生物传感器等方面具有广泛的应用前景，提高葡萄糖氧化酶的发酵效率以降低其生产成本对于该酶的生产和应用具有重要意义。为了在毕赤酵母中高效表达黑曲霉葡萄糖氧化酶，分别构建了组成型和诱导型表达葡萄糖氧化酶的毕赤酵母表达菌株，对毕赤酵母表达的葡萄糖氧化酶的酶学性质及糖基化进行了研究分析，并通过高效表达菌株筛选和高密度发酵较大程度地提高了萄萄糖氧化酶的表达量。研究表明，黑曲霉葡萄糖氧化酶可在毕赤酵母中组成型和诱导型表达，该酶的最适反应温度为35 ℃，50 ℃以上的温度会引起该酶的快速失活，表明该酶的热稳定性较低。该酶在毕赤酵母中表达会产生约30 kDa的糖基化修饰，这与文献[16-17]相一致。通过理性设计或定向进化方法改造黑曲霉葡萄糖氧化酶以提高其热稳定性可为实际生产和应用过程提供耐热性更高的酶，以减少该酶在使用中由于热失活造成的酶活损失并拓展其应用范围[18-20]。

为了提高葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的发酵量，构建了诱导型表达葡萄糖氧化酶的毕赤酵母工程菌株，得到了可在含有4 mg/mL G418的培养基上生长的菌株。研究表明，pPIC9K质粒载体上含有G418抗性基因，通过G418抗生素筛选可获得高效表达的含有多拷贝基因的工程菌株[21]。采用高密度发酵，甲醇添加量为2.5%条件下，葡糖糖氧化酶的表达量达到了较高酶量。与已报道葡萄糖氧化酶发酵水平相比该菌株具有较好的生产应用前景[22]。

3 结论

本研究成功实现了黑曲霉葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中组成型表达，对纯化后的葡萄糖氧化酶糖基化分析表明该酶在毕赤酵母中表达具有30 kDa左右的糖基化修饰，对葡萄糖氧化酶的酶学性质进行了分析。为了实现葡萄糖氧化酶的高效表达，构建和筛选了诱导型表达葡萄糖氧化酶的高效发酵工程菌株并对发酵条件进行了分析，为黑曲霉葡萄糖氧化酶的进一步放大生产和研究提供了试验依据。