植物乳杆菌灌胃对结肠异常隐窝灶大鼠肠道菌群结构及血清细胞因子水平的影响

王晨，韩艳，张旖晴

(中国中医科学院望京医院，北京 100102)

大肠癌是临床常见恶性肿瘤，严重危害人类健康，随着人们生活方式的转变及诊断水平的不断改进，其检出率有明显升高趋势[1]。大部分大肠癌患者就诊时已处于病变中晚期，临床治疗效果差，预后不良。因此，早发现、早治疗是提高患者生存率、改善预后的关键。1987年，Bird用实体镜在大肠癌动物模型中首次发现异常隐窝灶(ACF)。ACF是目前在光镜下能发现的最早期的结直肠癌癌前病变。ACF主要分布在直肠与左半结肠，常规内镜下无法观察到，需要用亚甲蓝或靛胭脂染色后用普通内镜即可观察到。研究显示，结肠高危肿瘤与ACF数目密切相关[2]。肠道菌群一般情况下处于平衡状态，如平衡状态被打破则发生肠道菌群失调，肠道微生态发生变化，部分肠道菌群可抑制炎症及肿瘤发展，而部分菌群则促进炎症及肿瘤发展，因此肠道菌群可能参与了大肠癌的发生发展。植物乳酸菌(LP)在多种生态环境中广泛分布，定植于哺乳动物的肠道，在肠道中分解为有益的小分子[3]。但LP对肠道菌群及细胞因子水平的影响，目前研究较少。2018年1月～2019年3月本研究对此作了探讨，为大肠癌的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 雄性SD大鼠72只，4周龄，体质量(130±10)g，购于北京中医药大学，自由饮食，温度22～26 ℃，湿度40%～50%。LP由本实验室培养保存。1，2-二甲基肼(湖北信康医药化工有限公司)，EDTA(美国Ambion公司)，0.2%亚甲蓝(青岛捷世康生物科技有限公司)，大鼠肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、IL-8试剂盒(Abcam公司)，TRIzol提取试剂盒(美国Ambion公司)，cDNA合成试剂盒(碧云天)。离心机(北京白洋淀医疗器械公司，BY-600A)，荧光定量PCR仪(上海之江生物科技有限公司，EX3600)，光学倒置显微镜(奥林巴斯，CHK)，酶标仪(帝肯贸易有限公司，TECANF50)。

1.2 ACF模型制备及干预 SD大鼠适应性喂养2周，将其随机分为对照组、模型组及干预组。模型组：于颈背部皮下注射1，2-二甲基肼30 mg/kg，注射后第7天给予PBS灌胃，1次/d，连续灌胃7 d；灌胃结束后第7天于颈背部第2次皮下注射1，2-二甲基肼30 mg/kg，第2次注射后第7天再次给予PBS灌胃，1次/d，连续灌胃7 d；第2次灌胃结束后第7天，于颈背部第3次皮下注射1，2-二甲基肼30 mg/kg。对照组：于颈背部皮下注射生理盐水+EDTA溶液，注射后第7天给予PBS灌胃，1次/d，连续灌胃7 d；灌胃结束后第7天于颈背部第2次皮下注射生理盐水+EDTA溶液，第2次注射后第7天再次给予PBS灌胃，1次/d，连续灌胃7 d；第2次灌胃结束后第7天，于颈背部第3次皮下注射生理盐水。干预组：于颈背部皮下注射1，2-二甲基肼30 mg/kg，第7天给予LP菌悬液1×1010CFU/mL灌胃，1次/d，连续灌胃7 d；灌胃结束后第7天于颈背部皮下注射1，2-二甲基肼30 mg/kg，第2次注射后第7天再次给予LP菌悬液1×1010CFU/mL灌胃，1次/d，连续灌胃7 d；第2次灌胃结束后第7天，于颈背部皮下第3次注射1，2-二甲基肼30 mg/kg。大鼠正常饮食。观察各组大鼠一般情况。

1.3 标本收集 分别于造模第1、9、18周3组各取8只大鼠，收集大鼠新鲜粪便标本，于-80 ℃保存；采集大鼠尾静脉血；然后用10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠，切开腹部皮肤，取结肠(从大鼠盲肠末端至骨盆的肛门)，沿肠长轴切开，用生理盐水重洗，除内容物，将结肠置于10%中性甲醛溶液中固定24 h。

1.4 ACF形成检测 取结肠组织标本，用0.2%亚甲蓝染色5 min后置于载玻片，在10倍显微镜下观察ACF形态结构并记录其数目。

1.5 大鼠肠道菌群结构检测 采用高通量测序技术。取大鼠粪便200 mg，加入70%乙醇1 mL，10 000 r/min离心3 min，弃上层液体，加PBS，10 000 r/min离心3 min，弃上清液；将离心管于吸水纸上倒置至无液体流出，55 ℃烘箱中放置10 min。用DNA提取试剂盒提取细菌总DNA，进行扩增与纯化，步骤严格按照说明书进行操作。高通量测序上机操作，根据操作分类单元(OTU)分类物种特定导出单个分类水平的样品进行比较，结果包括样品中所含的微生物种类。

1.6 血清细胞因子水平检测 采用ELISA法。分别于造模第1、9、18周采集大鼠尾静脉血1 mL，3 000 r/min离心10 min，取上清液，于-80 ℃保存。将血清解冻，按照试剂盒明进行操作，将标准品稀释，加样，于37 ℃温育30 min，洗涤，以上重复5次；加酶标溶液50 μL，于37 ℃温育1 h，洗板，依次加入显色剂A、B，避光反应15 min(25～37 ℃)，加入终止液50 μL，用酶标仪于波长450 nm处读取光密度值(OD值)。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较 造模后第1～9周各组大鼠均对外界刺激敏感，体质量增加迅速，对照组、模型组、干预组体质量分别为(497±11)、(455±17)、(472±10)g，但各组体质量比较差异无统计学意义。造模第10周，模型组大鼠皮毛暗淡无光泽，运动减少，反应缓慢，体质量降低；造模第20周，部分大鼠肛门变形。干预组大鼠仅于造模第13周出现精神不振。

2.2 各组大鼠结肠ACF形成情况比较 对照组大鼠结肠未见ACF形成。造模第9、18周，与对照组比较，模型组大鼠结肠ACF多(P均<0.05)；与模型组比较，干预组大鼠结肠ACF少(P均<0.05)。见表1。

表1 各组造模后ACF形成情况比较(个，

2.3 各组肠道菌群构成比较 模型组厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、疣微菌门比例较对照组高(P均<0.05)，拟杆菌门、螺旋菌门比例较模型组低(P均<0.05)。干预组拟杆菌门、螺旋菌门比例较模型组高(P均<0.05)，厚壁菌门、疣微菌门、放线菌门、变形菌门比例较模型组低(P均<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠肠道菌群构成(%)

2.4 各组血清细胞因子水平比较 对照组造模第1、9、18周血清TNF-α、IL-6、IL-8各时间点比较差异无统计学意义(P均>0.05)。模型组、干预组造模第1周血清TNF-α、IL-6、IL-8水平比较差异无统计学意义(P均>0.05)；造模第9、18周干预组血清TNF-α、IL-6、IL-8水平均低于模型组(P均<0.05)。见表3。

表3 各组血清细胞因子水平比较

3 讨论

结直肠癌是消化道常见恶性肿瘤，其发病率在全球范围内居恶性肿瘤第三位，每年新发病例约占每年确诊恶性肿瘤的10%。我国流行病学研究显示，每年100万人中有191人死于结直肠癌，且其发病率呈逐年上升趋势，且发病年龄趋于年轻化。由于大部分结直肠癌患者确诊时已是中晚期，因此如在临床能采取有效措施早发现、早治疗是改善患者预后的关键[4～6]。研究显示，ACF可作为结直肠癌的标记物，其数目>5个时可预测进展性肿瘤的发生[7]。因此了解ACF的特征及其与结直肠癌的关系，有重要临床意义。ACF经亚甲蓝染色后镜下可观察到。1，2-二甲基肼是致癌剂，可诱导大鼠形成结直肠癌，ACF为癌前病变，且早于腺瘤出现。本研究采用1，2-二甲基肼成功构建ACF大鼠模型。

LP是乳酸菌的一种，属于革兰阳性菌，其适宜生长温度为30～35 ℃，活菌数比较高，能大量的产酸。LP可通过调节肠道微生物群，抑制病原菌；调节肠相关淋巴样组织及上皮细胞的免疫应答。LP作为人体胃肠道的益生菌群，具有维持肠道内菌群平衡、提高机体免疫力和促进营养物质吸收等多种功能。LP在食品工业中应用十分广泛。由于对食盐、亚硝酸盐具有良好的耐受性，对蛋白质、脂肪无明显直接的分解作用等特点，在发酵肉制品中应用很多。同时，也广泛用于发酵植物性食品。此外，利用LP还可以生产共轭亚油酸[8～11]。本研究观察LP对ACF大鼠肠道菌群结构及血清细胞因子水平的影响。经LP干预后，大鼠于造模第13周才出现精神不振，而模型组大鼠于造模第10周就出现皮毛暗淡无光泽，运动减少，反应缓慢，体质量降低。且与模型组比较，干预组大鼠结肠ACF少。说明LP有效抑制了1，2-二甲基肼的致癌作用。

结直肠癌的发病除与遗传因素有关外，还有环境因素。大部分结直肠癌患者具有相似的饮食与生活习惯[12]。另外，慢性炎症也是结直肠癌的一个重要危险因素。炎症性肠病的发生发展与肠道菌群失调也有一定关系。人类胃肠道中大约存在100万亿微生物，大部分为细菌，其基因组含量超过人类基因组含量的100倍。微生物在人类疾病发展过程中发挥重要作用，正常情况下肠道微生物保持动态平衡，避免病原菌感染，维持健康状态。该平衡一旦被打破，可导致各种疾病。微生物可通过多种途径促进结直肠癌的发生发展[13～15]。本研究中，模型组厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、疣微菌门比例较对照组高，而拟杆菌门、螺旋菌门比例较模型组低。可见模型组大鼠被诱导形成早期结直肠癌前病变，大鼠肠道菌群出现紊乱。干预组拟杆菌门、螺旋菌门比例较模型组高，厚壁菌门、疣微菌门、放线菌门、变形菌门比例较模型组低。说明定植的LP能够调节大鼠的肠道菌群失调。研究显示，炎症及免疫反应是结直肠癌发生发展的危险因素[16]。

促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8与结直肠癌的发生发展有一定关系。结直肠癌患者血液中TNF-α、IL-6、IL-8水平高于健康人群，在结直肠癌发病早期起重要作用。TNF-α可激活STATS、NF-κB途径，促进氧化应激介导的DNA损伤，从而诱导癌症发生；IL-6通过诱导STATS活化，促进iNOS合成，导致DNA损伤，诱导癌症发生；肿瘤微环境中激活的IL-8是腺瘤向腺癌进展的调节因子[17]。本研究中模型组、干预组造模第9、18周血清TNF-α、IL-6、IL-8水平逐渐升高，说明肠道存在炎症反应。模型组、干预组造模第1周血清TNF-α、IL-6、IL-8水平比较差异无统计学意义；造模第9、18周干预组血清TNF-α、IL-6、IL-8水平均低于模型组。可见，LP可减轻1，2-二甲基肼导致的肠道炎症。

综上所述，LP作为益生菌，定植于肠道后减轻1，2-二甲基肼的致癌作用，能够调节大鼠的肠道菌群失调，减轻肠道炎症。但本研究并未对LP的具体作用机制进行探讨，后期将对其进行分析研究。