功能化自主装多肽RADKPS水凝胶对犬椎间盘退变的延缓作用

苏凌浩 ，裴世深，应金威，徐成，文天佑，阮狄克

(1南方医科大学，广州510000；2中国人民解放军总医院第六医学中心)

临床上对于由腰椎间盘退变而导致的下腰痛主要采取保守治疗和手术为主的综合治疗两种方法。然而，保守治疗只能缓解症状，并不能阻碍疾病的进一步发展；手术为主的综合治疗往往是患者最终的结局[1]，但是术后易出现并发症以及相邻节段的病变[2]。因此，寻求介于保守治疗和手术治疗之间的治疗方案，以期在椎间盘退变初期修复椎间盘，甚至逆转椎间盘退变形式成为新的研究热点。研究显示，生长因子在维持椎间盘内环境稳态中起重大作用。如BMP-7、BMP-2、TGF-β等能增加椎间盘内水含量，并促进Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成[3]。BMP-7在修复椎间盘损伤的过程中，不但能够促进Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达，还具有使骨髓间充质干细胞(BMSCs)向受损部位趋化迁移、促使BMSCs向软骨细胞分化和抑制髓核细胞凋亡的作用，因此非常有希望成为延缓椎间盘退变的种子因子。但与此同时，生长因子进入椎间盘后很快会被椎间盘自身内环境所代谢，存在时间较短，不能持续发挥其有效作用，往往需要多次注射。另一方面，BMP-7具有很强的成骨作用，直接注射到椎间盘体内，会造成一定的成骨风险[4]。本课题组前期将BMP-7的3个活性片段SNVI、KPSS和KAIS通过化学键方式结合在新型自组装纳米纤维支架材料RADA16-Ⅰ的C端，形成了3种不同的功能化自组装多肽。体外实验发现载有KPSS片段的RADKPS对人类退变的髓核细胞的生物学效应最强，且作用持续时间较长，同时成骨能力最弱。为此，本研究制作椎间盘退变模型，对RADKPS水凝胶在活体内对椎间盘的修复作用进行了观察。

1 材料与方法

1.1 主要材料 1岁龄健康的杂种犬16只(10～15 kg)，雌雄不限，由北京军事医学院动物中心提供。本研究获得中国人民解放军总医院第六医学中心伦理委员会批准。RADA16-Ⅰ、RADKPS多肽粉末各 100 mg(利用固相合成法合成，纯度>90%，上海生工生物工程股份有限公司)；胎牛血清(Gibco，美国)；LG-DMEM 培养基(Solarbio，中国)； PBS 缓冲液(Hyclone，美国)；番红O染色(碧云天生物技术公司)；HE染液(北京索宝生物科技有限公司)；胰酶(Gibco，美国)；聚集蛋白多糖/Ⅱ型胶原ELISA 检测试剂盒(Blue Gene，中国)；培养瓶(Corning，美国)抗犬聚集蛋白多糖/Ⅱ型胶原一抗(ABCAM，英国)；蛋白定量试剂盒(Thermo公司，美国)。

1.2 犬椎间盘退变模型制作及分组治疗干预 16只杂交犬，每只选取L3～4、L4～5、L5～6、L6～7椎间盘进行核磁共振检测，确保造模前每个腰椎间盘均未退变，均一性良好，参照文献穿刺制作椎间盘退变模型[5]。待椎间盘造模4周后，通过MRI检查测定椎间盘髓核区域以及相对部位脑脊液的灰度值，计算相对灰度值指数(RGI)，确认造模后椎间盘RGI较造模前明显下降，且均一良好，保证造模后L3～4、L4～5、L5～6、L6～7椎间盘之间RGI比较无统计学差异。然后，分别用4支不同的微量注射器(27 g)装载不同的药物注射椎间盘进行干预治疗。L3～4注射不含活性片段的RADA16-I水凝胶40 μL(RADA16-Ⅰ组)，L4～5注射PBS缓冲液40 μL(PBS组)，L5～6注射功能化自组装多肽RADKPS水凝胶40 μL(RADKPS组)，L6～7注射BMP-7 40 μL(BMP-7组)，L7～S1不做任何处理(正常对照组)。

1.3 椎间盘影像学观察 在造模前、造模4周、治疗12周进行X线检查，并通过公式算出椎间盘相对高度指数(DHI%)。DHI=2×(B1+B2+B3)/[(A1+A2+A3)+(C1+C2+C3)]。A1:上位椎体前缘高度；A2:上位椎体中央高度；A3:上位椎体后缘高度；B1:椎间盘前缘高度；B2:椎间盘中央高度；B3:椎间盘后缘高度；C1:下位椎体前缘高度C2；下位椎体中央高度；C3下位椎体后缘高度。DHI%=术后椎间盘DHI/术前椎间盘DHI。在造模前、造模4周及干预治疗4、8、12周5个时间点进行MRI检查，扫描采用 Turbo RARE T2WI序列，扫描主要参数:FOV 60 mm×40 mm, TR/TE4 200 ms/36 ms,层厚1.0 mm,层间距0.5 mm,FA 180°,Matrix 256 ×256,空间最小分辨。MRI成像水平扫描架内径16 cm,使用心脏线圈率为 234 μm×156 μm/像素，通过影像工作站的Manager软件测定椎间盘髓核区域以及相对部位脑脊液的灰度值，计算其RGI。

1.4 椎间盘组织学检查 在干预治疗12周，犬安乐死取出中心的髓核组织。用甲醛固定1周后给予石蜡包埋、切片，分别进行HE染色、Ⅱ型胶原和蛋白多糖免疫组化染色。利用计算机Image plus软件计算出图片的累计光密度值，除以染色区域面积，计算Ⅱ型胶原和蛋白多糖平均光密度值(AOD)。

1.5 椎间盘生化成分定量分析 干预治疗12周取出中心的髓核组织，EP管封存后，转存于-40 ℃冰箱备用，其过程均在无菌状态下操作。通过ELISA定量检测蛋白多糖和Ⅱ型胶原水平。

2 结果

2.1 实验动物一般情况 16只动物中，1只动物在术中因为麻醉过量而死亡，1只术后出现坐骨神经损伤的表现，但术后2月运动肌力恢复正常；其余实验动物未发生明显手术并发症，术后活动正常。死亡动物有样本补充。

2.2 各组X线检查椎间盘DHI%变化 与本组造模前比较，治疗12周BMP-7组、RADA16-Ⅰ组和PBS组椎间盘DHI%均降低(P均<0.05)，RADKPS组椎间盘DHI%无变化(P>0.05)。相同时间点比较，椎间盘DHI%正常对照组、RADKPS组、BMP-7组、RADA16-Ⅰ组、PBS组依次降低，组间比较差异有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1 各组不同时间点椎间盘DHI%变化

2.3 各组MRI检查椎间盘RGI变化 正常对照组各时间点RGI比较无统计学差异(P均>0.05)。治疗4、8、12 周3个时间点RGI比较，RADKPS组无统计学差异(P均>0.05)，BMP-7组、RADA16-Ⅰ组、PBS组差异均有统计学意义(P均<0.05)。治疗8 、12 周，组间两两比较，RGI差异有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2 各组不同时间点MRI检查椎间盘RGI变化

2.4 各组椎间盘组织HE染色情况 正常对照组髓核组织HE染色均一深度红染，含有大量团簇样细胞，分布均匀；RADKPS组髓核组织染色较为均一，可见少量团簇样细胞；BMP-7组、RADA16-Ⅰ组髓核组织团簇样细胞消失，髓核组织结构紊乱；PBS组髓核组织细胞数量明显减少，组织逐渐被胶原所取代。

2.5 各组椎间盘Ⅱ型胶原染色情况 BMP-7组和RADA-16组Ⅱ型胶原蛋白表达均较RADAKPS组明显降低，每高倍视野阳性细胞平均数明显降低，棕色阳性染色细胞数明显减少。正常对照组、RADKPS组、BMP-7组、RADA16-Ⅰ组、PBS组Ⅱ型胶原AOD值分别为0.800±0.023、0.653±0.032、0.252±0.023、0.233± 0.013、0.171±0.001，组间比较差异有统计学意义(P均<0.05)。

2.6 各组椎间盘蛋白多糖染色情况 BMP-7组和RADA16-Ⅰ组蛋白多糖表达为弱阳性，RADAKPS组与正常对照组阳性染色明显。正常对照组、RADKPS组、BMP-7组、RADA16-Ⅰ组、PBS组蛋白多糖AOD值分别为0.860±0.012、0.742±0.014、0.343±0.018、0.321±0.023、0.214±0.016，组间比较差异有统计学意义(P均<0.05)。

2.7 各组椎间盘蛋白多糖和Ⅱ型胶原水平比较 治疗12 周，各组椎间盘蛋白多糖、Ⅱ型胶原水平比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表3。

表3 治疗12 周各组Ⅱ型胶原、蛋白多糖水平比较

3 讨论

既往研究中，BMP-7之所以能够对椎间盘损伤产生很好的修复效果取决于其搭载3个活性片段SNVI、KPSS和KAIS。研究发现，KPSS的修复能力最强，同时成骨能力最弱。因此，KPSS活性短肽可望成为修复椎间盘退变的主要生物因子之一。BMP-7的3个活性片段SNVI、KPSS和KAIS通过化学键方式结合在RADA16-Ⅰ的C端，可形成3种不同的功能化自组装多肽。体外研究发现，载有KPSS片段的RADKPS对人类退变的髓核细胞的生物学作用最强，且作用持续时间较长[6]。Li等[7]发现,功能化自组多肽水凝胶RADKPS对凋亡诱导环境中髓核干细胞具有保护作用，提示其有作为退变椎间盘组织工程材料的潜能。Wu等[8]证实，RADKPS水凝胶既具有BMP-7促进Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达的作用，诱导骨髓间充质干细胞BMSCs向受损部位趋化迁移，并向软骨细胞分化，还能够持久在椎间盘内表达，减缓BMP-7的成骨风险。既往研究证实,修饰有BMP-7 功能片段的新型功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶RADKPS具有良好的细胞相容性、血液相容性及组织相容性[9]。此外RADA16-Ⅰ自身具有很强的机械特性，能够恢复椎间盘高度，且能够通过提高椎间盘内水含量从而促进椎间盘的修复。因此,RADKPS水凝胶有望成为椎间盘修复构建组织工程髓核的理想材料之一。

犬椎间盘与人椎间盘形态上较为相似，大小适中，适合观察，且犬的脊索细胞自幼年期开始就逐渐减少，适宜作为研究对象。纤维环穿刺负压抽吸制作椎间盘退变模型，重复性良好，通过控制不同节段的负压强度及持续时间可以控制椎间盘损伤层度从而制造退变均一的模型。在动物实验和临床研究中，没有症状的椎间盘退变主要靠影像学检查来判断。早期影像学主要表现为MRI检查中T2相上髓核组织灰度值减低，退变髓核呈现黑色信号改变；随着退变的加重，后期X线平片出现椎间盘高度的下降。本研究采取髓核相对灰度值判断椎间盘影像上信号的变化，比起单纯依靠肉眼观察的Pfirrmann分级定性标准能够更加准确量化退变的严重程度。在本研究中，RADKPS水凝胶组术后椎间盘高度和灰度均得到有效保持，表明髓核含水量得到有效维持，延缓了椎间盘退变进展。治疗前后DHI%对比也验证了RAKPSS水凝胶组椎间盘高度要比造模后其他组保持更良好的状态。另一方面，组织学检测可以从微观角度评估椎间盘细胞及细胞外基质的变化。髓核组织切片HE染色结果表明，RADKPS水凝胶延缓了髓核细胞丢失的速度，较好地保持了髓核组织形态结构及细胞外基质。椎间盘细胞外基质主要包括蛋白多糖和Ⅱ型胶原，椎间盘退变时蛋白多糖、Ⅱ型胶原含量降低。本研究免疫组化染色结果显示，RADKPS组蛋白多糖、Ⅱ型胶原表达深染区域明显多于对照组，ELISA定量分析显示RAKPSS组蛋白多糖、Ⅱ型胶原含量也得到了有效保留。

本研究还存在一些不足之处，如X线的拍摄时间未能做到和MRI同步、未做到大样本分时间段多次取标本进行生化定量分析、未进行单个运动节段的生物力学分析、观察时间短等。因此，RAKPSS水凝胶延缓椎间盘退变的作用尚需要进一步研究。