狼疮性肾炎患者血清miR-4532、miR-2861表达变化及临床意义

郭军利，沈东波，李学刚，张慧涛

(1 珠海市人民医院 暨南大学附属珠海医院，广东珠海 519000；2 中山大学附属第五医院)

狼疮性肾炎(LN)属于系统性红斑狼疮最为常见的一种并发症，发病率为60%～80%，可能引起不同程度的肾损伤，病情严重时甚至可能引起死亡。该病的治疗重点在于早期准确的诊断以及治疗，从而避免肾衰竭的发生[1]。当前临床上主要是通过24 h尿蛋白定量、肾小球滤过率、系统性红斑狼疮疾病活动度评分(SLEDAI)以及补体C3、C4水平等指标协助LN的诊断以及评估其活动性。IL-6、IL-18是重要的免疫因子，参与免疫调节及调控炎症介质。炎症介质在LN的发生、发展过程可加剧炎症反应以及增加肾脏功能损伤[2]。miRNA作为非编码RNA之一，可通过和靶mRNA的3′-UTR以及5′-UTR区碱基互补配对，促使其发生降解或抑制其翻译，进一步介导炎症反应的发生、发展过程，参与多种生理以及病理过程，被认为是最为理想的生物标志物，可能成为LN的有效诊断指标[3]。目前，临床上已有研究报道表明，miR-4532、miR-2861在糖尿病肾病患者的尿液中表达降低，且和肾小球滤过率以及肾间质纤维化密切相关[4]。然而，关于上述两项指标在LN患者血清中表达的相关研究并不多见。因此，本研究观察了LN患者血清miR-4532、miR-2861表达变化，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年1月～2018年12月珠海市人民医院和中山大学附属第五医院接受诊治的LN患者80例作为研究对象。纳入标准：所有研究对象符合美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟所制定的LN相关诊断标准[5]，且均接受临床检查、影像学检查以及实验室检查等确诊为LN；年龄≥18周岁；入院前未接受降尿酸药物、保肾药物以及利尿剂等药物治疗。排除标准：入院前7 d内进食高脂高蛋白食物以及大量饮酒等；合并高血压、糖尿病等基础疾病者；心、肝、肺等重要脏器发生病变者；交流沟通障碍或伴有精神疾病者。将其根据SLEDAI评分分为活动期组(SLEDAI评分≥10分)42例与稳定期组(SLEDAI评分<10分)38例。其中活动期组男4例、女性38例，年龄22～58(32.32±5.33)岁，体质量指数(BMI)18.33～30.31(24.61±4.66)kg/m2。稳定期组男3例、女35例，年龄22～59(31.36±5.25)岁，BMI 18.29～30.35(24.57±4.62)kg/m2。另取同期珠海市人民医院接受体检的健康人员40例作为对照组，其中男5、女35例，年龄21～58(32.39±5.29)岁，BMI 18.24～30.37(24.66±4.65)kg/m2。三组基本资料比较差异无统计学意义，具有可比性。本研究经珠海市人民医院伦理委员会批准通过，所有研究者知情同意。

1.2 血清miR-4532、miR-2861检测 采集所有受试者清晨空腹肘静脉血5 mL，3 000 r/min离心10 min，将获取的血清保存于-80 ℃冰箱中备用。采用RNA提取纯化试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)提取血清总RNA，随后采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测各组血清miR-4532、miR-2861。以U6为内参对照，反应程序为94 ℃ 2 min进行1个循环，94 ℃ 40 s、60 ℃ 40 s、72 ℃ 1 min完成35个循环，最后72 ℃、5 min完成1个循环。miR-4532上游引物序列为5′-CCTGGAAAGAATGGAGATGA-3′,下游引物序列为5′-GCACCATCCAAACCACTG-3′。miR-2861上游引物序列为5′-GTCATAGTGCTGGATGGT-3′，下游引物序列为5′-CGGTGGAAGAATACTTATTG-3′。通过2-ΔΔCt法计算miR-4532、miR-2861相对表达量。通过酶联免疫法检测血清IL-6、IL-18水平，试剂盒购自上海吉泰依科赛生物科技有限公司。采用贝克曼IMMAGE800特定蛋白分析仪测定C3、C4及24 h尿蛋白定量。采用肾动态显像法测定肾小球滤过率。

2 结果

2.1 各组血清miR-4532、miR-2861表达比较 活动期组、稳定期组血清miR-4532、miR-2861表达均较对照组低(P均<0.05)，且活动期组较稳定期组低(P均<0.05)，见表1。活动期组、稳定期组肾小球滤过率、补体C3、C4水平均较对照组低(P均<0.05)，且活动期组较稳定期组低(P均<0.05)，见表1。活动期组、稳定期组血清IL-6、IL-18、24 h尿蛋白定量水平较对照组高(P均<0.05)，且活动期组较稳定期组高(P均<0.05)，见表1。

表1 各组血清miR-4532、miR-2861表达及相关实验室指标比较

注：与对照组相比，#P<0.05；与稳定期组相比，*P<0.05。

2.2 LN患者血清miR-4532、miR-2861表达与各实验室指标的相关性 LN活动期组患者血清miR-4532、miR-2861表达与血清IL-6、IL-18、24 h尿蛋白定量以及SLEDAI评分均呈负相关，而与肾小球滤过率呈正相关(P均<0.05)，见表2；而稳定期组患者血清miR-4532、miR-2861表达与各实验室指标无相关性。

表2 LN活动期组患者血清miR-4532、miR-2861表达与各实验室指标的相关性

2.3 血清miR-4532、miR-2861诊断LN的价值 经ROC曲线分析可得：血清miR-4532诊断LN的ROC曲线下面积为0.732(95%CI：0.651～0.834)，最佳阈值为7.58，敏感度为81.14%，特异度为64.23%；而miR-2861诊断LN的ROC曲线下面积为0.741(95%CI：0.623～0.802)，最佳阈值为8.90，敏感度为78.35%，特异度为66.82%。

3 讨论

LN是指系统性红斑狼疮并发双肾功能显著受损的一种免疫性疾病，患者主要临床表现囊括蛋白尿、肾功能下降以及血尿等，其发病可能和免疫细胞、细胞因子以及免疫复合物形成等多种免疫异常密切相关[5]。已有研究[6]表明，Th1/Th2细胞因子平衡失调在体内许多自身免疫性疾病包括系统性红斑狼疮中发挥重要且关键的作用。IL-18和IL-6作为Th1和Th2重要的细胞因子，在诊断LN以及评估疾病的活动性方面发挥着重要的作用[7]。相比正常人以及稳定期患者，活动期LN患者IL-18和IL-6明显升高。然而，机体自身炎症以及免疫状态容易影响IL-18和IL-6的水平，蛋白尿和补体C3、C4的水平也容易受到其他因素的影响[8]。因此上述实验室指标诊断LN的特异性较差，临床应用存在一定的局限性。

miRNA是一类长21～25 nt的单链小分子RNA，来源于染色体的非编码区，具有高度保守性，能够在转录后水平上对基因的表达进行负调控，主要参与调控人体30%左右的基因表达，作用涉及到生长发育和细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程。肾脏中也会特异地缺失或者低表达某些特异miRNA，能够通过调控靶基因，产生调节肾脏功能的特异性蛋白，介导肾脏疾病的发生和发展[9]。且近年来研究[10,11]证实，miRNA可能通过调控机体的淋巴细胞功能以及免疫细胞反应活性，继而参与LN的发生、发展过程。而miR-4532、miR-2861是近年新发现的具有调控机体淋巴细胞功能以及免疫细胞反应活性的miRNA。目前，临床上有学者认为遗传、性激素、环境、病毒感染以及药物等多因素共同作用是LN的发病机制[12]。而随着相关研究的不断深入，不少学者发现LN的发病可能和淋巴细胞功能异常以及细胞因子的异常表达密切相关，且炎症可能在LN的发病过程中起着至关重要的作用[13]。miR-4532、miR-2861能否通过调控炎症因子的表达活性影响疾病的活动性，值得临床深入探讨和研究。

本研究结果发现，LN活动期组血清miR-4532、miR-2861较对照组和LN稳定期组低，且活动期组IL-6、IL-18、24 h尿蛋白定量水平较高，肾小球滤过率及补体C3、C4水平较低，提示血清miR-4532、miR-2861表达可能与LN患者的活动性有关，且活动期LN患者临床肾功能低下，反映活动性的指标升高。此外，本研究还发现，LN活动期组血清miR-4532、miR-2861表达与血清IL-6、IL-18水平均呈负相关关系。提示LN活动期患者的血清miR-4532、miR-2861表达下调可能对其肾损伤程度以及机体炎症水平发挥负调控作用。分析原因，IL-6主要是由T淋巴细胞以及B淋巴细胞等细胞分泌而来的细胞因子，参与了多种自身免疫性疾病的发生、发展过程，其表达异常增高极易引起机体免疫调节的紊乱，从而在LN的发病中起着至关重要的作用。IL-18属于促炎症细胞因子之一，可通过和内皮细胞表面的蛋白多糖相结合，同时促进白细胞和内皮及内皮下基质相结合，从而促进白细胞的渗出游走，进一步促进炎症的发生，继而增加LN的发生风险[14]。杲和艳等[13]研究同样表明，miR-4532、miR-2861表达与LN的活动性和炎症水平相关。由此可见，miR-4532、miR-2861表达升高可以通过调控降低IL-6和IL-18水平，在减轻肾脏炎症和损伤方面起到重要的保护作用。

肾小球滤过率主要是指肾脏于单位时间内所生成的超滤液量，在肾功能评估中价值较高[15]。有研究[16,17]发现，糖尿病肾病患者血清miR-4532、miR-2861表达降低与肾小球滤过率、肾间质纤维化/肾小管萎缩存在一定相关性。另有研究学者[18]提出，LN患者miRNA表达的异常可能与毛细血管内皮细胞炎症具有相关性。本研究发现，LN活动期组血清miR-4532、miR-2861表达与肾小球滤过率呈正相关。推测当血清miR-4532、miR-2861表达降低时，对下游相关的炎症介质如IL-6和IL-18调控能力减弱，血清IL-6和IL-18的表达水平升高，激活血管内皮炎症活动，进而介导炎症损伤以及肾脏纤维化，最终导致肾功能下降和肾小球滤过率降低。此外，血清miR-4532、miR-2861表达与24 h尿蛋白定量、SLEDAI评分呈负相关，24 h尿蛋白定量、SLEDAI评分作为反映LN患者活动性的指标，上述结果提示血清miR-4532、miR-2861表达降低在介导炎症损伤和肾脏纤维化的同时，还可以对肾小球滤过膜造成损伤，导致蛋白尿的产生和疾病的活动性增加。

本研究ROC曲线分析发现，血清miR-4532、miR-2861对LN的诊断效能均高。由于LN属于自身免疫介导的,以免疫性炎症为突出表现的疾病。而miR-4532、miR-2861能够通过炎症介质IL-6和IL-18参与机体内皮细胞炎症的调节，因此在LN的诊断和活动性评估方面具有重要的作用，可以作为LN的早期诊断和活动性评估的生物学标志物。

综上所述，miR-4532、miR-2861在LN患者血清中表达降低，其表达下降可以反映LN患者的炎症反应和疾病的活动性，亦可以反映肾功能损伤情况，对LN临床诊断和病情评估具有重要的应用价值。