老年冠心病患者血清miRNA-34a表达及其临床意义

刘艳宾 杨树涵 陈红伟 邢永生

新乡市中心医院心血管内科

冠心病（coronary heart disease，CHD）基本病理特征以冠状动脉形成粥样硬化性斑块为主，当动脉内不稳定的斑块发生破裂后会诱发急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI），AMI 发病凶险且是心内科常见的急危重症之一［1］。微小RNAs（microRNAs，miRNAs）为长度18～22 nt 的非编码RNA，在靶基因转录和蛋白翻译的过程中发挥显著作用［2］。报道［3-4］显示，miRNAs 在CHD 基本病理特征如动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的发生、发展中扮演了重要角色，miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c 共同构成miRNA-34 家族，其中miRNA-34a 在心脏组织中呈现高表达［5］。研究［6］发现，miRNA-34a 在含有粥样硬化样斑块的动脉中表达显著升高，且miRNA-34a 可作为心源性死亡和心力衰竭的一项预测指标［7］，但目前国内关于CHD 患者血清miRNA-34a 相对表达水平研究较少，且与CHD 患者临床特征的相关性尚不明确，因此，本研究通过RT-PCR 法探讨CHD 患者血清miRNA-34a 的相对表达量并探讨其临床意义，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料回顾性收集2016年1月1日至2019年1月1日于我院心内科住院且诊断明确的195例CHD 患者血清及其临床资料，其中稳定型心绞痛（stable angina pectoris，SAP）组87例、急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）组108例。CHD 患者排除标准为具有心肌疾病病史、心脏瓣膜病史、先天性心脏病、合并严重肝肾功能不全、风湿免疫性疾病及恶性肿瘤等。CHD 患者组男94例，女101例，平均（68.63 ± 9.25）岁；另选取我院性别及年龄相匹配且经过冠脉造影排除冠脉病变的60例正常体检者作为对照组，男33例，女27例，平均（64.28 ± 7.55）岁。上述研究对象均知情同意且签署知情同意协议书，本研究经过我院伦理委员会批准（伦理号：20151143）。

1.2 研究方法

1.2.1 血清标本收集清晨空腹抽取所有研究对象外周静脉血3 mL 于试管中，静置20 min 后于转速为8 000 r/min 的4 ℃离心机中离心10 min，为去除残余细胞成分，取上层血清转移至另一试管中，再次于转速为13 000 r/min 的4 ℃离心机中离心10 min，最后取500 μL 血清转移至无RNA 酶的EP管中分装，放入-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 总RNA 提取及浓度测定取出样本后快速置于37 ℃水浴锅中解冻，每管加入700 μL Trizol 后震荡并静置3 min，再加入0.2 mL 氯仿震荡并静置3 min，离心后取上层水相于新的无RNA 酶的EP 管中，再次加入等体积异丙醇混合静置并离心除去上清液，使用1 mL 75%DEPC 酒精洗涤沉淀并室温干燥，最后加入25 μL DEPC 处理的ddH2O水溶解RNA。总RNA 浓度采用紫外分光光度计测定其吸光度（A260/A280），当A260/A280值为1.8～2.2后继续下一步实验。

1.2.3 逆转录和实时荧光定量-PCR按照逆转录试剂盒进行逆转录反应（miScript II RT 逆转录试剂盒，德国QIAGEN 公司），反应体系为：miScriptHispct（5x）4 μL，miScriptNucleics（10x）2 μL，miScript Reverse Transcriptase 2 μL，RNA 模板12 μL。逆转录条件：37 ℃60 min，95 ℃10 min。最后加入80 μL ddH2O 水稀释。按照试剂盒进行qPCR 反应（miScript SYBR Green 试 剂 盒，德 国QIAGEN 公司），反应体系10 μL：预加热95 ℃30 min，变性94 ℃15 s，退火55 ℃30 s，延伸70 ℃30 s，共40 个循环。Ct 值为反应孔的荧光信号达到设定阈值的循环数。采用U6 作为内参，血清中miRNA-34a 的相对表达量为2-△Ct=CtmiRNA-34a-CtU6。

1.3 基本资料的收集和血清学指标的检测研究对象的基本资料如性别、年龄、吸烟饮酒史、高血压及糖尿病病史、体质量指数（body mass index，BMI）等均从住院病历中获得；血清学指标如血脂、总胆红素、血糖、血尿酸、超敏C 反应蛋白等数值均为次日清晨空腹抽取外周静脉血于我院化验科检测所得。

1.4 冠状动脉血管病变程度评定所有研究对象均采用Gensini 积分系统评估冠脉病变情况［8］，冠脉按照冠脉狭窄程度≤25%、26%～50%、51%～75%、76%～90%、91%～99%和100%依次得1、2、4、8、16 分和32 分；节段积分为该节段冠脉得分乘以相应系数，具体为左主干得分× 5、左前降支近段得分×2.5、中段得分×1.5、远段得分×1、第一对角支得分× 1、第二对角支得分× 0.5、左回旋支近段得分× 2.5、远段和后降支均得分× 1、后侧支得分× 0.5、右冠近、中、远段和后降支均得分×1，最终Gensini 积分为各分支积分之和。

1.5 统计学方法采用SPSS 17.0 统计学软件进行数据处理。计量资料符合正态分布，以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，不符合正态分布则以中位数和四分位数表示，两样本比较采用Mann-Whitney 检验；计数资料采用χ2检验；多组间比较采用方差分析；相关性分析和多因素分析分别采用Spearman 相关检验和Logistic 回归分析，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组、SAP 组和ACS 组3 组研究对象一般临床资料的比较3 组研究对象在LDL-c、超敏C反应蛋白、吸烟史和Gensini 积分上存在显著差异，其余指标未见明显差异。见表1。

2.2 对照组、SAP 组和ACS 组3 组研究对象血清miRNA-34a 的相对表达量的比较ACS 组、SAP组和对照组血清miRNA-34a 相对表达量中位数及四分位数分别为0.79（0.65，0.91），0.46（0.42，0.53）和0.25（0.18，0.41），3 组间比较差异具有统计学意义（F=23.641，P＜0.05），其中ACS 组血清miRNA-34a 相对表达量显著高于SAP 组及对照组，SAP 组血清miRNA-34a 相对表达量显著高于对照组，差异均具有统计学意义（统计量分别为6.120，8.768和5.449，均P＜0.05）。见图1。

表1 3 组研究对象一般临床资料的比较Tab.1 Comparison of clinical data among three groups ±s，M（P25，P75）

表1 3 组研究对象一般临床资料的比较Tab.1 Comparison of clinical data among three groups ±s，M（P25，P75）

注：TG，甘油三酯；TC，血清总胆固醇；HDL-c，高密度脂蛋白胆固醇；LDL-c，低密度脂蛋白胆固醇

项目男性［例（%）］平均年龄（周岁）BMI（kg/m2）TG（mmol/L）TC（mmol/L）HDL-c（mmol/L）LDL-c（mmol/L）总胆红素（μmol/L）脂蛋白（mg/L）空腹血糖（mmol/L）血尿酸（μmol/L）超敏C 反应蛋白（mg/L）高血压［例（%）］糖尿病［例（%）］吸烟史［例（%）］饮酒史［例（%）］Gensini 积分对照组（n=60）33（55.00）64.28±7.55 26.34±1.47 1.06（0.74，1.6）4.12±0.23 1.12±0.18 1.54±0.42 9.36（6.58，16.47）256.36±36.57 5.31±1.12 326.47±45.44 3.45±1.32 18（30.00）23（38.33）31（51.67）25（41.67）3.12±1.47 SAP 组（n=87）46（52.87）67.46±8.46 25.42±3.46 1.13（0.82，1.53）3.58±0.64 1.04±0.16 3.54±1.13 10.24（8.79，16.37）275.46±40.12 5.46±1.74 300.28±34.57 5.28±2.34 32（36.78）28（32.18）63（72.41）42（48.28）20.16±6.43 ACS 组（n=108）48（44.44）69.46±8.32 25.79±2.53 0.91（0.71，1.44）4.94±0.28 1.35±0.24 3.87±0.29 8.69（6.01，15.22）239.18±40.27 5.92±1.45 330.36±54.21 10.52±1.46 46（42.59）43（39.81）82（75.93）61（56.48）45.36±12.34 P 值＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＜0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＜0.05＞0.05＞0.05＜0.05＞0.05＜0.05

2.3 195例CHD 患者血清miRNA-34a 相对表达量与冠脉病变严重程度的相关性将195例CHD患者按照冠脉病变支数分为1支病变组（n=73）、2支病变组（n=72）和3 支病变组（n=50），3 组患者血清miRNA-34a 相对表达量分别为0.82（0.53，0.74）、0.61（0.49，0.55）和0.40（0.34，0.49），3组比较差异具有统计学意义（F=18.531，P＜0.05）。195例CHD 患者Gensini 积分平均为（36.45±1 0.43），相关性分析结果显示，血清miRNA-34a相对表达量与Gensini积分呈显著正相关性，相关系数r=0.756，P＜0.001。

2.4 多因素Logistic 回归分析将发生冠心病为因变量，以表1 中所有指标（除Gensini 积分之外）和血清中miRNA-34a 为自变量进行Logistic 回归分析，分析结果显示LDL-c（OR=3.236）和miRNA-34a（OR=4.129）是发生冠心病的独立危险因素；将所有研究对象血清miRNA-34a 相对表达量为因变量，表1 中所有指标（除Gensini 积分之外）为自变量进行Logistic 回归分析，分析结果显示LDL-c（OR=5.341）是CHD 患者血清miRNA-34a 相对表达量的独立危险因素。见表2、3。

表2 冠心病危险因素的Logistic 回归分析Tab.2 Risk factors of coronary heart disease by Logistic regression analysis

表3 冠心病患者血清miRNA-34a 相对表达量的危险因素的Logistic 回归分析Tab.3 Risk factors for the relative expression of serum microRNA-34a in patients with coronary heart disease by Logistic regression analysis

图1 对照组、SAP 组和ACS 组3 组研究对象血清miRNA-34a 的相对表达量Fig.1 Expression of serum microRNA34a levels in control group，SAP group and ACS group

3 讨论

本研究发现，CHD 患者血清miRNA-34a 相对表达量显著升高，且miRNA-34a 与CHD 患者冠脉病变严重程度具有显著正相关性，这进一步证实miRNA-34a 可能参与了CHD 的发病机制。ACS 患者相对于SAP 患者短期及长期预后均较差，我们亚组分析结果显示，ACS 组miRNA-34a 的相对表达量显著高于SAP 组，故而miRNA-34a 在一定程度上可能与CHD 患者临床转归显著相关。FUKUI 等［9］比较382例ACS 和851例SAP 患者临床资料后发现，ACS 组患者手术死亡率和低输出量综合征发生风险均显著高于SAP 组患者（2.6%vs.0.1%；3.1%vs. 1.2%，均P＜0.05）；LV 等［7］发现，相对于无左室重构组患者而言，miRNA-34a 在左室重构组患者表达水平显著升高，且miRNA-34a 水平的升高是死亡及心力衰竭的危险因素（OR=4.18）。另一方面，笔者通过Logistic 回归分析发现，miRNA-34a 和LDL-c 均是发生CHD 的危险因素，且LDL-c 是miRNA-34a 水平升高的一项独立影响因素，既往研究均已证实，LDL-c 可通过多种途径参与了CHD 的发病机制，本研究认为LDL-c 可能是通过促进miRNA-34a 的过度表达而参与了CHD 的发病，但是具体机制尚待进一步进行研究。

冠状AS 是CHD 发病的重要病理生理基础，而血管内皮细胞和血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）是参与AS 发生发展的重要组成细胞［10］。多项研究［11-13］发现miRNA-34a 可通过多种机制作用于血管内皮细胞和VSMC 而参与AS的发生、发展。血管内皮细胞发生老化及凋亡是导致内皮功能障碍及AS 形成的关键性环节，动物实验［11］发现，相对于正常小鼠而言，AS 模型小鼠大动脉中miRNA-34a 表达水平显著升高，且当小鼠给予抗miRNA-34a 处理后，血管内皮细胞凋亡比例显著下降，同时发现与凋亡相关蛋白如Bax、Caspase-3 及9 均显著下调，而抗凋亡相关蛋白如Bcl-2 表达却显著升高；MiRNA-34a 高表达后可抑制沉默信息调节因子2 相关酶1（Silent information regulator factor 2-related enzyme 1，SIRT 1），诱导促炎因子如血管细胞粘附分子1 及IL-6 等生成，从而导致内皮细胞炎症反应，同时SIRT 1 还具有防止内皮细胞老化及凋亡等功能［12］。VSMC 的增殖在AS 斑块形成早期及血管损伤时较为显著，VSMC除了具有稳定纤维帽作用外，VSMC 的迁移也认为在AS 的形成过程中发挥关键作用［13-14］。血管内皮干细胞可分化为VSMC，而miRNA-34a 通过SIRT1诱导干细胞向VSMC 分化，导致VSMC 在血管内膜大量积聚，最终促进了血管内As 斑块形成及管腔狭窄［15］。血管钙化是心血管疾病患者死亡风险增加的主要因素之一，而血管钙化的本质是骨化型VSMC 细胞过多，BADI 等［16］对比miRNA-34a+/+和miRNA-34a-/-小鼠后发现，miRNA-34a+/+小鼠动脉中膜的钙沉积及血管钙化标志物Runx2 和Sox9 表达均显著升高，miRNA-34a 能够通过下调SIRT1 从而引起VSMC 老化，诱导VSMC 分化型向骨化型转化，最终导致动脉壁钙化。

综上所述，本研究新颖之处在于首次证实CHD 患者血清中miRNA-34a 表达水平显著上调，可作为反映CHD 冠脉病变严重程度的一个血清学指标，且与CHD 发病具有一定联系，这也为miRNA-34a 将来是否可以作为CHD 治疗的一个作用靶点提供思路。但本研究的局限性在于未探讨miRNA-34a 促进CHD 患者AS 发生发展中的具体作用机制，同时CHD 患者血清中miRNA-34a 的表达量上调仍需要大量样本量进一步证实，此外，CHD 患者冠状动脉斑块中miRNA-34a 的表达水平仍需要进一步探讨；在未来，仍需要大样本量的队列研究来证实miRNA-34a 高表达是否增加CHD 患者AS 的发生风险。