非小细胞肺癌患者外周血中lncRNA SNHG5 的表达及诊断意义

陈刚 史少明 邢雅军 李双根 魏晨晨

南京鼓楼医院高淳分院（南京市高淳人民医院）1呼吸内科，2肿瘤内科（南京211300）；3南京医科大学第一附属医院肿瘤科（南京210000）

根据美国癌症协会数据，非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）占所有男性癌症死亡人数的26%，和女性癌症死亡人数的25%［1］。尽管NSCLC 在手术、放射治疗和抗癌药物方面进展迅速，但NSCLC 患者的5年生存率仍然很低，仅为16.6%［2-3］。因此，迫切需要利用潜在的机制来鉴定肿瘤发展过程中异常表达的基因，并借此建立具有高敏感性和特异性的新型生物标志物，以促进NSCLC 的早期诊断和治疗。

根据ENCODE 联盟的研究，人类70%的基因组被转录为非编码RNA 分子。非编码RNA 之前一直被当做转录“垃圾”，但现有的研究逐渐发现lncRNA 的细胞功能包括调节细胞增殖和分化或癌症进展和入侵，它们参与多种癌症的发生发展［4］。近年来的研究发现多种lncRNA 在NSCLC患者中存在异常表达，可通过表观遗传、转录及转录后翻译等多种途径参与NSCLC 的发生、发展及侵袭转移等过程［5］。此外，研究人员发现lncRNAs可以在血清中稳定的表达，并能够对NSCLC 进行早期诊断［6］。由于传统肿瘤生物标志物对早期NSCLC 的敏感性和特异性有限，如癌胚抗原（CEA）、鳞状细胞癌（SCC）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）和细胞角蛋白199（CA199），筛选其他替代分子作为NSCLC 的诊断、预后和预测生物标志物变得至关重要。

研究发现，lncRNA PVT1［7］、DANCR［8］、ZEB1-AS1［9］、SNHG5［10］和HOTTIP［11］在NSCLC 组织中异常表达，并与肺癌细胞的增殖、凋亡和化疗药物耐药有关。但是，截止目前，并未有研究检测上述这些lncRNA 在NSCLC 患者血清中的表达水平。因此，本研究通过检测NSCLC 患者血清lncRNA 表达，与健康者和肺良性结节患者血清lncRNA 表达水平进行比较，筛选出异常表达的lncRNA。有研究结果显示只有血清SNHG5 表达水平在NSCLC中下调。因此，本研究进一步探讨血清SNHG5 与NSCLC 患者病情的相关性，及其在NSCLC 患者中的临床诊断价值，为NSCLC 的早期诊断提供新型潜在性的生物学标志物。

1 材料与方法

1.1 材料血清和组织RNA 提取试剂TRIzol 购自美国Invitrogen 公司；cDNA 反转录试剂盒（PrimeScriptTMRT Master Mix）、RT-qPCR 试剂盒（SYBR Premix Ex Taq Ⅱ）购自日本TaKaRa 公司；lncRNA 和内参基因由上海生工公司合成。

1.2 方法

1.2.1 研究对象收集2017年9月至2018年9月在我院就诊的NSCLC 患者60例，男45例，女15例，年龄38～79 岁，平均（52.45 ± 4.39）岁。纳入标准：（1）经病理组织学确诊为NSCLC；（2）入组前未接受肺癌相关的手术、化放疗或生物学治疗；（3）根据国际抗癌联盟的TNM 分期标准［12］，研究对象包括Ⅰ期15例，Ⅱ期26例，Ⅲ期19例。排除标准：（1）合并有其他恶性肿瘤；（2）患者临床资料不完整；（3）既往接受过其他抗癌治疗；（4）入组前半年内接受过手术治疗。此外，纳入同期在本院健康体检人群60例为健康对照组，男44例，女16例，年龄35～75 岁，平均（52.45 ± 4.39）岁。并纳入同期经手术治疗确诊为肺良性结节（最大直径≤3.0 cm）的38例患者，男22例，女16例，年龄37～70 岁，平均（53.61±6.53）岁。收集并记录NSCLC 患者吸烟史、肿瘤大小和TNM 分期等数据。所有研究对象均签订知情同意书。经我院伦理委员会审批同意。

1.2.2 样本采集抽取所有研究对象空腹静脉血3 mL 于促凝管中，室温垂直静置半小时后，常温下1 500 r/min 离心10 min，吸取上层液体至标记好的EP 管中，-80 ℃保存备用。同时，留取NSCLC 患者术后1 d、1 周及1、2、4 和6 个月的血标本，按照上述方法准备血清样本。

1.2.3 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测组织或血清lncRNA 表达用TRIzol 提取各组织或血清的总RNA，通过NanoDrop ND1000 分光光度计（Thermofisher 公司）确定RNA 纯度和浓度。随后，对总RNA 进行反转录反应得到cDNA。采用RTqPCR 检测血清SNHG5 和内参基因GAPDH 的表达，反应体系为：Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，DEPC 水6 μL。PCR 扩增条件为：第一阶段：95 ℃5 min），第二阶段：95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，35 个循环，每组样品重复3 次。基因的相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。GAPDH 正向引物：5′- CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3′。反向引物：5′- AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′；PVT1 正向引物：5′- CTAATTATTCGGTAACTGACTTGA-3′。反向引物：5′- ACAGTTCAGCCAATCACTTGGA-3′；DANCR 正向引物：5′-CTGCATTCCTGAACCGTTATCT-3′。反向引物：5′-GGGTGTAATCCACGTTTCTCAT-3′；ZEB1-AS1 正向引物：5′-TTGGCACATACAGCCATC-3′。反向引物：5′-TACCCTGCACAAACCCGAAA-3′；SNHG5 正向引物：5′-TACTGGCTGCGCACTTCG-3′。反向引物：5′-CAGTAAAAGGGGAACACCA-3′；HOTTIP 正向引物：5′-CACACTCACATTCGCACACT-3′。反向引物：5′-TCCAGAACTAAGCCAGCCATA-3′。

1.3 统计学方法采用SPSS 23.0 统计软件进行统计分析，计量数据以（）表示。两组间比较分析使用独立样本t检验；多组间均数比较采用单因素方差分析；计数资料比较用χ2检验；受试者工作曲线（ROC）用于评估SNHG5 对NSCLC 的诊断价值，并计算ROC 曲线下面积（AUC）及95%置信区间（95%CI），并计算相应的敏感性和特异性。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SNHG5在NSCLC组织和血清的表达水平本研究检测既往报道在NSCLC 组织中异常表达的5种lncRNA 在NSCLC 患者和健康体检者血清中的表达情况。结果表明：健康体检者、肺良性结节和NSCLC 血清中SNHG5 的表达水平分别为（2.03 ±0.63）、（1.94 ± 0.53）和（1.61 ± 0.57），比较差异有统计学意义（F= 8.48，P＜0.01）；两两多重比较结果显示，NSCLC 血清中SNHG5 表达低于健康体检者（t= 5.69，P＜0.01）和良性结节患者（t= 3.46，P= 0.01）；而3 组对象血清PVT1、DANCR、ZEB1-AS1 和HOTTIP 表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 NSCLC、肺良性结节患者和健康体检者血清5 种lncRNA 表达水平Tab.1 Levels of 5 serum lncRNAs in patients with NSCLC，benign pulmonary nodules and healthy subjects ±s

表1 NSCLC、肺良性结节患者和健康体检者血清5 种lncRNA 表达水平Tab.1 Levels of 5 serum lncRNAs in patients with NSCLC，benign pulmonary nodules and healthy subjects ±s

分组健康对照组良性结节组NSCLC 组F 值P 值例数60 38 60 PVT1 0.79±0.14 0.86±0.17 0.82±0.11 1.74 0.18 DANCR 0.32±0.10 0.30±0.13 0.35±0.09 2.85 0.07 ZEB1-AS1 1.39±0.83 1.27±0.95 1.48±0.75 0.74 0.48 SNHG5 2.03±0.63 1.94±0.53 1.61±0.57*8.48＜0.01 HOTTIP 0.04±0.02 0.03±0.03 0.05±0.02 2.59 0.06

2.2 血清SNHG5 与NSCLC 患者临床病理特征的相关性进一步分析血清SNHG5 在NSCLC 中的临床意义， 将NSCLC 患者按照血清SNHG5 的中位数为1.68，分成SNHG5 低表达组和SNHG5 高表达组，每组30例，并分析比较两组患者的临床病理特征见表2。SNHG5 低表达与肿瘤大小和有相关性（P= 0.036），但与性别、年龄、吸烟和临床TNM 分期无相关性（均P＞0.05）。随后，进一步比较不同分期的NSCLC 患者血清SNHG5 的表达情况（图1），发现Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期的NSCLC 患者血清SNHG5 表达为（1.20 ± 0.59）、（1.70 ± 0.47）和（1.80 ± 0.54）。与肺良性结节患者比较，Ⅰ期NSCLC 患者血清SNHG5 表达下降，差异有统计学意义（P＜0.001）。根据上述结果，笔者推测SNHG5 的下调可能与NSCLC 的病情有关，尤其是NSCLC 早期。

2.3 NSCLC 患者血清SNHG5 水平与NSCLC 临床常用指标的相关性为了进一步探讨血清SNHG5 水平与临床NSCLC 传统指标（包括CEA、NSE、CA125 和CA199 等）的相关性，60例NSCLC 患者根据本院规定的正常参考值被分为2 组（表3）。结果发现，血清SNHG5 水平与NSE、CA125 无关，而与CAE和CA199有关（P＜0.05）。

2.4 手术对NSCLC 患者血清SNHG5 水平的影响鉴于血清SNHG5 水平与临床NSCLC 严重程度的相关性，笔者进一步分析手术对血清SNHG5水平的影响。结果显示：术后1 d 血清SNHG5 水平较术前轻度下降（P =0.005）；术后1 周血清SNHG5 水平较术前相比，差异无统计学意义（P=0.538）。术后个1～6 个月，血清SNHG5 水平较术前均明显增加，1、2、6 个月的水平分别为（1.91 ±0.73）、（2.03 ± 0.54）和（2.13 ± 0.64）（与术前比较P＜0.05）。见图2。

表2 NSCLC 患者血清SNHG5 水平与临床病理特征的相关性Tab.2 Correlation between serum SNHG5 levels and clinicopathological features in patients with NSCLC例

图1 肺良性结节患者和不同分期的NSCLC 患者血清SNHG5 的水平比较Fig.1 Comparison of serum SNHG5 levels in patients with benign pulmonary nodules and NSCLC patients with different stages

表3 NSCLC 患者血清SNHG5 水平与血清指标的比较Tab.3 Comparison of serum SNHG5 levels and serum indicators in patients with NSCLC ±s

表3 NSCLC 患者血清SNHG5 水平与血清指标的比较Tab.3 Comparison of serum SNHG5 levels and serum indicators in patients with NSCLC ±s

变量CEA（μg/L）≤5.0＞5.0 NSE（ng/mL）≤18.3＞18.3 CA125（U/mL）≤35＞35 CA199（U/mL）≤37＞37例数42 18 49 11 47 13 46 14血清SNHG5 水平1.84±0.52 1.31±0.37 1.79±0.67 1.42±0.53 1.55±0.55 1.49±0.36 1.96±0.48 1.22±0.32 t 值3.712 1.711 0.370 5.398 P 值0.002 0.093 0.712＜0.001

图2 NSCLC 患者术前和术后血清SNHG5 的水平（n=60）Fig.2 Serum SNHG5 levels in preoperative and postoperative NSCLC patients

2.5 SNHG5 对NSCLC 的诊断价值基于上述结果，ROC 曲线方法被用于分析血清SNHG5 对NSCLC 的诊断价值分析，见表4、图3。在本研究中，CEA 用 于 诊 断NSCLC 的AUC 值 为0.667（0.575～0.750），敏感性和特异性为61.67%和78.33%；CA199 用于诊断NSCLC 的AUC 值与CEA类似，为0.667（0.575～0.750）；而SNHG5 用于诊断NSCLC 的AUC 值为0.735（0.647～0.812），敏感性和特异性为68.33%和76.67%，较CEA 和CA199 提高。同时，CEA 或CA199 联合SNHG5 均可以提高诊断NSCLC 的价值。并且，三者联合诊断NSCLC的价值可提高至0. 796（0.713～0.864），敏感性和特异性为65.00%和83.33%。

表4 ROC 分析不同血清指标对NSCLC 的诊断价值Tab.4 ROC analysis of the diagnostic value of different serum indicators for NSCLC

图3 SNHG5 联合CEA 和CA199 在预测NSCLC 中的ROC曲线分析比较Fig.3 Comparison of ROC Curves in SNHG5 Combined with CEA and CA199 when Predicting NSCLC

3 讨论

众所周知，早期诊断是提高肺癌患者生存率的主要途径，但目前仍难以实现。包括CEA、NSE和CA125 等在内的单一血清学指标对肺癌的诊断敏感性和特异性通常不能令人满意，特别是对于早期临床分期［13］。

lncRNA 是一组长度超过200 nt 而没有蛋白质编码能力的RNA 分子，最近成为全球研究的焦点［14］。越来越多的研究表明，lncRNAs 在癌症如乳腺癌、宫颈癌和肺癌中发挥着重要作用［15］。由于可能检测到癌症患者的血浆或甚至尿液中的lncRNA，它们可以用作早期诊断癌症的生物标志物。例如，LI 等［16］发现126例NSCLC 患者血清lncRNA AFAP1-AS1 表达小副增加，其与肺癌病灶大小、病例分期和转移相关；同时AFAP1-AS1 诊断NSCLC 的AUC 值为0.759（0.692～0.826）。而谭楠等［17］的研究结果表明，NSCLC 患者血清中H19 的表达水平与患者淋巴结转移及TMN 分期有关。这些发现均表明lncRNA 可以作为肺癌诊断和预后的分子生物标志物。

本研究通过查询有关文献，发现PVT1、DANCR、ZEB1-AS1、SNHG5 和HOTTIP 等5 种lncRNA均被报道证实在NSCLC 组织或细胞中异常表达且参与NSCLC 的生物学活性。但是截止目前，并未有研究检测这5 种lncRNA 在NSCLC 患者血清的表达情况。通过RT-qPCR 实验，笔者发现上述lncRNA 中只有血清SNHG5 的水平在NSCLC 患者和对照组（包括良性肺结节和健康体检者）中有差异。SNHG5 是5'TOP 家族的一员，其可促进肝癌细胞的增殖和侵袭［18］。在NSCLC 中，SNHG5 表达下降，且过表达SNHG5 可增加NSCLC 细胞对易瑞沙的敏感性［10］。本研究首次检测NSCLC 患者血清SNHG5 的表达，发现与NSCLC 组织表达类似，血清SNHG5 表达也显著下降。目前对于血清SNHG5 的研究较少。只有ICHIGOZAKI 等［19］发现在恶性黑色素瘤患者的血清中表达下降，但其并未进一步探讨其临床意义。本研究首次探讨血清SNHG5 在NSCLC 患者中异常表达。血清中SNHG5 的表达水平与患者年龄、性别及吸烟无相关性，但与病灶大小有关，提示其可能参与NSCLC 的增殖但仍需要动物在体和离体细胞实验证明SNHG5 参与NSCLC 的增殖。此外，虽然Ⅱ期和Ⅲ期患者血清SNHG5 水平与健康体检者差异无统计学意义，Ⅰ期NSCLC 患者血清SNHG5 水平显著低于肺良性结节患者，提示SNHG5 具有早期诊断NSCLC 的价值。但是，本研究纳入的病例缺乏Ⅳ期患者，故仍需要扩大样本，进一步分析血清SNHG5 在NSCLC 中的临床意义。同时，本研究还发现，术后患者血清SNHG5 水平与术前比较，具有显著增加的趋势，提示SNHG5 在评估NSCLC 术后病情方面也有潜在价值。但需要纳入术后复发患者来验证这一假设。

此外，本研究进一步比较了SNHG5 与传统诊断NSCLC 的血清学指标，发现SNHG5 与CEA 和CA199 相关，进一步比较了以上3 者诊断NSCLC 的价值。结果发现，SNHG5 诊断NSCLC 的价值均高于CEA 或CA199。鉴于目前多指标联合诊断可显著提高诊断价值［20］，笔者分别联合了2 项或3 项指标，发现联合三项指标诊断NSCLC 的AUC 值达0.796，显著高于单项或2 项指标的AUC 值，且具有较高的特异性（83.33%），表明联合检测血浆SNHG5、CEA 和CA199 早期诊断NSCLC 具有可行性，可考虑在临床使用。

综上所述，本研究首次发现SNHG5 在NSCLC患者血清中表达下降，并且SNHG5 表达水平与NSCLC 患者肿瘤大小相关；Ⅰ期NSCLC 患者血清SNHG5 较健康者下降。此外，SNHG5 表达水平与CEA 和CA199 相关；血清SNHG5 可用于早期诊断NSCLC，且在评估NSCLC 术后病情方面也有潜在价值。