雷公藤多苷联合淫羊藿苷对强直性脊柱炎小鼠病理性骨紊乱的干预效果

邹宇聪 刘刚 高彦平 殷海东 毛筝

南方医科大学第三附属医院1康复医学科，2中医骨伤科（广州510630）；3南方医科大学顺德医院骨科（广州528300）

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）隶属中医痹证范畴，是一种慢性炎症性疾病，易引起关节强直，功能活动丧失［1］。AS 前期和中期主要包括炎症反应和病理成骨两个阶段，但在AS 病理进展后期存在着一个矛盾现象，即AS 附着点发生病理性骨化，出现“骨痹”，但松质骨（如椎体）却存在骨质疏松，表现“骨痿”征象［2］。研究［3］显示在AS患者中骨质疏松的检出率超过50%，而10年内椎体和股骨颈发生骨密度降低的概率分别为54%和51%［4］。一项回顾性研究［5］显示，与健康人群相比，AS 患者更容易发生骨折，而且骨折发生率随着患病时间增长而升高，在疾病诊断后20～30年，骨折发生率达到最高为17%。

雷公藤多苷（tripterygium glycosides，TG）和淫羊藿苷（icarrin，Ica）分别是中医临床中常用通痹方和补肾方中的代表成分，本研究在笔者前期单纯应用雷公藤多苷的基础上进一步联合应用淫羊藿苷治疗AS，探讨联合应用TG 和Ica“补肾除痹法”是否可以同时抑制AS 的病理性骨化和骨质疏松。

1 材料与方法

1.1 蛋白多糖（PG）的提取和AS 造模蛋白多糖购自Sigma，雌性Balb/c 小鼠60 只购自北京维通利华公司，SPF 级别动物房饲养，在第0、3、6 周应用提取好的上述100 μg 软骨蛋白聚糖腹腔注射，首次和末次PG 注射时加入完全弗氏佐剂（Difco，Detroit，MI，美国），第2 次注射时加入不完全弗氏佐剂（Difco）。5 只不进行造模作为空白对照组，造模过程中密切检测小鼠的生命活动情况。55 只小鼠造模过程中，有4 只在造模过程中因免疫反应死亡，2 只在影像学检查中因麻醉过量死亡，36 只小鼠经确定造模成功，造模成功率为73%（接近文献75%的成功率）。在第16 周时将36 只造模成功的实验小鼠分为单纯TG 组（n＝12）、TG 联合Ica组（n＝12）和0.9%生理盐水组（阴性对照组）进行灌胃（n＝12）。前述空白对照组不进行任何干预（n＝5），观察期间密切注意小鼠生命体征，采用小动物MRI 观察造模情况。

1.2 TG 溶液配制和Ica 灌胃TG 溶液的配制：雷公藤多苷片（安徽新陇海，国药准字号Z34021048）研磨成细粉，将TG 药粉用0.5%CMC-Na 液配制成每0.5 mL 含生药0.9 mg 的混悬溶液，按9.1 mg/kg灌胃，每日1 次。Ica（上海友思生物技术有限公司，规格：20 mg/支，批号：110323）；Ica 组的小鼠灌胃剂量为20 mg/kg，（换算方法：TG 人的用药剂量为1 mg/kg，Ica 人的用药剂量为2.2 mg/kg，查人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表得到人与小鼠的系数为0.002 6，TG：给药1.0 × 70＝70 mg，于是小鼠的使用剂量为70 × 0.002 6/0.02＝9.1 mg/kg；Ica 苷70 kg 人给药2.2 × 70＝154 mg，于是小鼠的使用剂量为154×0.002 6/0.02＝20 mg/kg）。

1.3 HE 染色检测骶髂关节组织学改变于首次注射蛋白聚糖后第6、8、12、16、20 和24 周，取各组小鼠骶髂关节固定在4%的福尔马林中，4 ℃条件下0.5 mol/L EDTA 脱钙直至骨组织变得柔软，石蜡组织包埋，切片，观察；应用HE 染色检测骨破坏或病理性骨化情况。

1.4 MicroCT 检测骨密度和骶髂关节骨化情况将小鼠麻醉后，置于MicroCT 下进行扫描观测，对准骶髂关节平面以及L1～4平面和股骨平面，扫描层间距为12 μm，分辨率为12.5 μm，电压为80 kV，电流为0.18 mA，功率为9 W，扫描角度为14 400，每秒1 帧，将每个样本进行三维重建，观测小鼠骶髂关节病理性骨化情况，并测量椎体骨密度的改变。

1.5 Real-time PCR 检测骶髂关节BMP-2、ALP，OCNmRNA 以及miR-21 的表达为了探讨雷公藤多苷以及淫羊藿苷治疗AS 可能的作用机制，本研究应用Real-time PCR 对成骨相关基因BMP-2、ALP，OCN mRNA 以及miR-21 进行定量分析并进行比较。骶髂关节组织总RNA 的提取及逆转录从样本保存液中取出，根据RNA 提取试剂盒上的操作步骤进行（TAKARA，日本）。RT-PCR 反应以GAPDH 和U6 作为内标基因，设计BMP-2、ALP，OCN mRNA 以及miR-21 四种引物的序列：BMP-2：F：5′-GCTTCCGCTGTTTGTGTTTG-3′，R：5′-GGTCACAGATAAGGCCATTGCGAPDH-3′；OCN-F：5′-GGACATTACTGACCGCTCCT-3′-R：5′-TTTTCAGTGTCTGCCGTGAG-3ALP F：5′-ACGAGGTCACGRCCATCCT-3′，R：5′-CCGAGTGGTGGTCACGAT-3′miR-21：F：5′-ACGTTGTGTAGCTTATCAGACTG-3′，R：5′-AATGGTTGTTCTCCACACTCTC-3′GAPDH：F：5′-GAATTTGCCGTGAGTGGAGT-3′R：5′-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3′；U6，F：5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC - 3′ ， R：5′ - AAATATGGAACGCTTCACGA -3′反应条件均为：95 ℃3 s，95 ℃5 s，60 ℃34 s，循环40 次。每标本检测2 次。根据最终的优化体系，比较目的基因与内标基因GAPDH 和U6 的扩增效率的斜率回归有无显著性差异。如果没有显著性差异，应用比较阈值法即2-△△Ct，所得结果表示目的基因相对于正常对照组的倍数，如果有显著性差异，按Rasmussen 计算出相对表达差异，每次实验均重复3次。

1.6 统计学方法统计学方法应用Graphpad Prism 6.0 软件对所得数据进行统计学分析，实验数据以均数±标准差表示，两组数据比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One way ANOVA），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠造模观测在第9 周左右观察到小鼠外周关节红、肿等关节炎等表现。第16 周小动物MRI 显示骶髂关节出现不同程度的破坏，表明造模成功（图1A）。HE 染色病理分析显示PGIA 模型病变关节主要表现为淋巴细胞的浸润和组织水肿，并伴有关节间隙多型核细胞的浸润以及滑膜巨噬细胞和成纤维样细胞的增殖，骶髂关节软骨侵蚀（图1B）。

图1 造模后骶髂关节变化情况Fig.1 Change of sacroiliac joint after AS modeling

图2 TG 联合Ica 对骶髂关节病理性成骨的影响Fig.2 Effect of TG and Ica on the pathological bone formation in sacroiliac joint

2.2 雷公藤多苷联合淫羊藿苷对病理性成骨的影响与空白对照组（图2D）相比较，TG 组骶髂关节局部有炎症稍有少许新骨增生（图2A），TG 联合Ica 组骶髂关节稍有新骨形成但未发生关节间隙未融合（图2B），而单纯生理盐水组骶髂关节发生破坏几乎完全发生融合（图2C）。表明TG 可以防止骶髂关节进一步融合，TG 联合Ica 并未显著性 增加骶髂关节融合。

2.3 雷公藤多苷联合淫羊藿苷对骶髂关节成骨基因BMP-2、ALP、OCN mRNA 以及miR-21 的影响从图3 中可以看出相对于空白对照组，单纯造模组骶髂关节组成骨基因BMP-2、ALP、OCN mRNA以及miR-21 表达均显著升高；相对于单纯造模组，雷公藤多苷组和雷公藤多苷联合淫羊藿苷组显著抑制了各组骶髂关节成骨相关基因BMP-2，ALP 以及OCN mRNA的表达，而雷公藤多苷联合淫羊藿苷组相对雷公藤多苷成骨基因BMP-2、ALP 以及OCN mRNA 稍有升高趋势，但差异没有统计学意义；单纯造模组miR-21 显著高于空白对照组，但雷公藤多苷组可显著抑制miR-21 的表达，而雷公藤多苷联合淫羊藿苷组与雷公藤多苷组miR-21 表达差异无统计学意义（图3）。这些研究结果表明，在应用雷公藤多苷的基础上联合应用淫羊藿苷并不会显著增高骶髂关节病理性骨化的可能性。

2.4 雷公藤多苷联合淫羊藿苷对小鼠股骨以及椎体骨密度的影响TG 组股骨骨密度显著低于空白对照组，略低于单纯模型组，TG 联合Ica 组股骨骨密度显著高于TG 组（图4A）；TG 组以及单纯模型组椎体骨密度显著低于空白对照组和TG 联合Ica 组（图4B）。这些研究结果表明，Ica 可以显著防止TG 所带来的骨密度丢失。

图3 TG 联合Ica 对骶髂关节成骨基因和miR-21 的影响Fig.3 Effect of TG and Ica on the osteogenesis gene and miR-21 in sacroiliac joint

图4 TG 联合ICa 对小鼠股骨以及椎体骨密度的影响Fig.4 Effect of combination use of TG and Ica on the femur and spinal bone mineral density

3 讨论

祖国医学认为AS 为早期“筋痹”，脊柱关节周围的附着点发生炎性增生等改变，表现在“筋”。而中晚期“骨痹”表现为附着点的病理性骨化，并腐蚀结合部的松质骨。如新生的骨质生成过多、整体脊柱的关节囊和韧带病理性骨化，并且发生椎体骨小梁丢失，骨质疏松，最终出现“骨痿”。而AS“筋痹”到，“骨痹”再到“骨痿”之间传变关系正符合西医“炎症-骨转化”的过程。所以在早中期控制筋骨之痹，从痹论治，防止终末出现“骨痿”，是AS 治疗成功与否的关键［6］。久痹者必伤肾，《千金要方》强调“腰背痛者皆是肾气虚弱”，即是说肾虚是AS 的根本。肾虚在AS 的病情发展中起了举足轻重的作用。因此从以上论述看来，“补肾除痹”是十分科学的防治AS 的重要治疗手段［7］。

TG 是从雷公藤提取由我国自主研发的具有强大抗风湿作用的化合物，对AS 临床疗效明显，可显著降低AS 患者血沉和C 反应蛋白水平，还可以明显改善晨僵，Schober 指数、疼痛和僵硬指数、外周关节和中轴关节症状以及功能障碍的程度，具有较高的安全性和耐受性［8］，然而TG 治疗AS 的作用机制尚无定论。笔者的前期研究［9］发现TG的有效成分雷公藤红素可在体外抑制AS 髋关节囊成纤维细胞的增殖和骨化；还发现在炎症刺激状态下，TG 在体外可以抑制AS 成纤维细胞miR-21 和成骨因子的表达［10］。淫羊藿苷具有免疫调节、抗肿瘤、影响心脑血管系统和生殖等多种重要的生物活性，是一类应用前景广阔的中药单体。有研究［11］表明淫羊藿苷不仅可以防止骨质疏松，还可以抑制在体外抑制AS 成纤维细胞发生病理性成骨［12-13］，这为淫羊藿苷治疗AS 提供了基础。

miR-21 是调节成骨细胞分化和矿化的重要因子［14］，在成骨细胞分化时与多种成骨如ALP，BMP-2 以及OCN 等基因同时表达［15］，而最近研究发现miR-21 在AS 进展中具有重要作用。TNF-α 是触发AS“炎症因子风暴”级联瀑布效应的关键因子，而研究发现TNF-α 可以诱导miR-21 持续表达上调［16］。巨噬细胞是引起AS 骨破坏的主要炎症细胞，而LPS 刺激巨噬细胞后可显著上调miR-21 的表达，同时伴随着TNF-α 等细胞因子分泌模式的改变。过表达miR-21 会使TNF-α 的分泌降低，调节巨噬细胞的细胞因子分泌模式，起到抗炎的作用［17］。最近HUANG 等［18］发现miR21 在AS 患者血清中的表达要明显高于对照组，笔者团队近期临床研究［19］发现AS 患者血清中miR-21 表达与AS 病理性骨化呈正相关，但与椎体骨密度呈负相关。

本研究发现TG 可以防止骶髂关节进一步融合，但会引起骨质疏松，而TG 联合Ica 并未显著性增加骶髂关节融合，本研究还发现TG 组以及单纯模型组椎体骨密度显著低于空白对照组和TG 联合Ica 组，表明Ica 可以显著防止TG 所带来的骨密度丢失，因此联合应用TG 和Ica 既可以防止AS 小鼠病理性骨紊乱，为临床以雷和淫羊藿为基础的补肾除痹方治疗AS 提供了实验基础，未来期望进一步对其潜在机制进行探讨。