抗阻运动对力竭游泳小鼠动脉粥样硬化易损斑块的影响

王瑶 马骏 杨丰 张群辉 钟俊达， 黄建玉 郭丹霞， 姜文才 徐琳

1广州中医药大学研究生院（广州510403）；2中国人民解放军南部战区总医院心血管内科（广州510010）；3南方医科大学（广州510515）

冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary heart disease，CHD）已成为危害人类健康的“头号杀手”，最新数据表明CHD 病死率增长迅猛，与10年前相比，城市增加1.63 倍，农村增加3.98 倍。其中急性冠脉事件发病凶险，严重威胁人们的生命［1］。研究［2-3］显示，约70%的急性冠脉事件是由动脉粥样硬化斑块破裂引起的，易损斑块是罪魁祸首［4］。

力竭运动是疲劳长期积累而引起机体功能紊乱的病理状态。力竭运动时机体血液中的儿茶酚胺水平升高，心脏负荷加重，同时机体水分蒸发快、血液黏稠度增高、血管内皮损伤，易出现血小板聚集和血栓形成，引起心肌严重缺血，甚至导致猝死［5-6］。然而力竭运动是否直接诱导易损斑块破裂还未得到证实。

CHD 是内外因共同作用的复杂过程，离不开长期慢性炎症累积，抗阻运动在CHD 防治方面已被证实有一定成效，研究［7-8］表明抗阻运动可增加骨骼肌质量和力量，提高基础代谢率，加强运动耐力，通过降低血清炎症因子水平改善机体的慢性炎症状态。但抗阻运动对易损斑块的影响尚不知晓。本研究探讨力竭游泳运动诱导易损斑块破裂，抗阻运动对易损斑块稳定性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物8周龄SPF级C57BL/6J背景ApoE-/-雄性小鼠30 只，体质量18～22 g，购自南京大学-南京生物医药研究院，许可证号SCXK（苏）2015-0001，饲养于南部战区总医院（原广州军区广州总医院）动物实验中心，室温22～24 ℃，相对湿度50%，光照时间7：00～19：00，适应性喂养1 周，高脂饮食（主要成分0.15%胆固醇、21%脂肪和15.5%蛋白质），购自广东省医学实验动物中心，本实验通过实验动物伦理委员会批准，符合实验动物伦理和实验动物福利。

1.2 实验过程

1.2.1 实验动物模型全部ApoE-/-雄性小鼠适应性高脂喂养1 周后行左侧颈总动脉套管术，腹腔麻醉（3%戊巴比妥，2 mL/kg），于气管旁找到左侧颈总动脉，小心分离，套入硅胶管，实验全程高脂饮食饲养。

1.2.2 力竭运动的实施力竭游泳运动采用水迷宫作为小鼠游泳槽，内壁光滑，水温控制在（32 ±2）℃之间，室温控制在21～23 ℃，相对湿度40%～60%，水深为小鼠（身长+尾长）×1.5 倍，小鼠尾部负重2%的体质量负荷。正式实验前1 天进行1 次热身运动以适应游泳。

力竭标准：小鼠连续3 次沉入水底，每次超过5 s，不能自主浮上水面；同时观察小鼠身体状况，当出现协调运动丧失，放在平面上无法完成翻正反射时即从水中捞出。每次游泳运动结束后均擦除水分，并使用吹风机吹干皮毛。每次游泳至力竭标准。力竭游泳运动共进行14 d，1 次/d，于最后1 次力竭游泳运动后即刻取材。

1.2.3 抗阻运动的实施参考过往文献报道［9，12］的方法，ApoE-/-小鼠颈动脉套管术后于第10 周龄开始进行7 d 渐进性递增负荷的爬梯训练。爬梯高为1.1 m，间隔为2 cm，倾斜角度为85°。第一周为适应性训练，以不负重起始，每天以10%体质量的负荷递增（负荷使用橡皮泥绑在小鼠尾巴根部），终负荷为体质量的70%，每天进行两组，每组重复3 次，组内休息1 min，组间休息2 min，5 d/周，持续8 周。

1.2.4 动物分组及处理将ApoE-/-小鼠称重后，小鼠的体质量为（22.93± 1.26）g，随机分为对照组（Ctl 组）、力竭组（Exh 组）、抗阻+力竭组（Res+Exh组），分组完成后，打耳标，Ctl 组编号1、2、3、4……；Exh 组11、12、13、14……；Res+Exh 组21、22、23、24、25……。全程高脂喂养，全部小鼠行颈总动脉套管术，Ctl 组正常活动10 周，术后Exh 组先正常活动8 周再进行2 周力竭游泳运动，Res+Exh 组先进行8 周抗阻运动再进行2 周力竭游泳运动。结束后取血，标本离心取上清；冰生理盐水、4%多聚甲醛心脏灌流取出颈总动脉，4%多聚甲醛固定，分别石蜡包埋和冰冻切片。颈总动脉段剪下，生理盐水清洗，迅速置液氮速冻，后转移至-80 ℃冰箱保存。

1.3 组织病理学和免疫组织化学从石蜡包埋的颈总动脉根部起始制成5 μm 厚度连续切片，行HE 染色观察斑块大小及纤维帽厚度、Masson 染色观察胶原成分。冰冻切片上行油红O 染色观察脂质沉积，免疫组化检测巨噬细胞、平滑肌细胞在局部的表达。光学显微镜下观察其病理形态。利用IPP 图像分析系统，计算斑块面积大小、纤维帽厚度和易损指数［易损指数=（巨噬细胞+脂质）面积阳性%/（平滑肌细胞+胶原）面积阳性%］。

1.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）用ELISA 试剂盒检测血清血脂水平总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）浓度。

1.5 统计学方法数据的统计采用SPSS 21.0（IBM 公司，美国）和GraphPad Prism 7 统计软件处理。计量资料以表示，计数资料以率或构成比表示。K-S 检验对数据进行正态性分析，数据呈正态分布，3 组组间比较比较用方差分析，两两比较用SNK 法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠实施力竭运动和抗阻运动与Ctl 组相比，体质量、血脂水平、病理免疫组化检测指标的变化情况实验后3 组的体质量均上升，其中Res+Exh 组上升幅度最小；血脂水平抗阻运动得到改善；病理学检测结果力竭运动对斑块破裂影响最大，而抗阻运动对其有减少作用。见表1。

抗阻运动和力竭游泳运动开始前，3 组小鼠的体质量均为（22.93 ± 1.26）g，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。高脂饮食后3组体质量均上升，Ctl组（27.46±1.59）g上升最明显，Res+Exh组（25.74 ± 0.75）g 上 升 幅 度 小 于Exh 组（27.46 ±1.59）g，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 颈总动脉斑块面积大小、纤维帽厚度、脂质沉积、胶原成分的比较颈动脉石蜡切片HE 染色病理结果显示，Ctl 组无斑块形成，Exh 组斑块面积最大。见图1。

斑块大小、纤维帽厚度、脂质沉积和胶原成分3 组比较，斑块大小Ctl 组（131.12 ± 2.91）μm2，Exh组（178.94 ± 3.74）μm2，Res+Exh 组（94.84 ± 3.74）μm2，Exh 组斑 块 面积大于Ctl 组和Res+Exh 组，Res+Exh 组最小，差异有统计学意义（P＜0.001）。Exh 组纤维帽厚度（1.31 ± 0.04）μm 比Ctl 组（3.07± 0.12）μm 和Res+Exh 组（5.65 ± 0.25）μm 薄，Res+Exh 组的纤维帽最厚（P＜0.05）。Exh 组（57.56 ±1.12）%胶原 成分 少 于Ctl 组（65.47 ± 0.69）%和Res+Exh 组（69.57 ± 0.64）%，脂 质 沉 积Exh 组（17.29 ± 1.2）%大于Ctl 组（15.37 ± 1.59）%和Res+Exh 组（13.01±0.97）%，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 3 组体质量、病理指标、血脂水平情况Tab.1 Three groups of body mass，pathological indicators，blood lipid levels ±s

表1 3 组体质量、病理指标、血脂水平情况Tab.1 Three groups of body mass，pathological indicators，blood lipid levels ±s

注：与Ctl 组相比，*P ＜0.05

指标体质量（g）实验前实验后斑块面积（10 μm2）纤维帽厚度（μm）脂质沉积（%）胶原成分（%）血管平滑肌细胞（%）巨噬细胞（%）易损指数（%）TC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）Ctl 组（n=10）23.32±1.45 27.46±1.59 131.12±2.91 3.07±0.12 15.37±1.59 65.47±0.69 6.07±0.27 1.48±0.23 0.24±0.02 16.91±0.25 1.14±0.47 18.94±2.64 5.54±0.53 Exh 组（n=10）22.72±1.31 27.46±1.59*178.94±3.74*1.31±0.04*17.29±1.25*57.56±1.12*4.44±0.33*2.68±0.51*0.32±0.02*16.97±0.22*1.15±0.44*18.91±2.56*5.47±0.48*Res+Exh 组（n=10）22.75±1.03 25.74±0.75*94.84±3.74*5.65±0.25*13.01±0.97*69.57±0.64*6.63±0.24*1.90±0.23*0.20±0.01*15.69±0.63*0.89±0.40*16.43±3.08*5.99±0.56*

2.3 颈总动脉斑块局部巨噬细胞、平滑肌细胞的表达Exh 组巨噬细胞表达率（2.68 ± 0.51）%高于Ctl 组（1.48±0.23）%和Res+Exh 组（1.90±0.23）%，相反，SMC Exh 组（4.44 ± 0.33）%最少，Ctl 组（6.07± 0.27）%比Res+Exh 组（6.63 ± 0.24）%少（P＜0.05）。见表1。

2.4 各组易损指数的比较Exh 组（0.32±0.02）%易损指数明显高于Ctl 组（0.24 ± 0.02）%和Res+Exh 组（0.20±0.01）%，Res+Exh 组高于Ctl 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

2.5 3 组血清血脂指标的比较3 组血清TG、TC、LDL-C 、HDL-C 水平比较差异有统计学意义。Ctl组血脂水平高于Exh 组和Res+Exh 组（P＜0.05），Res+Exh 组最低（P＜0.05）。见表1。

3 讨论

动脉粥样硬化是冠状动脉粥样硬化性心脏病的病理基础，易损斑块破裂则是引起急性冠脉事件的元凶。力竭状态是指动物或人进行运动时，直到完全不能运动为止的现象，是疲劳长期积累而引起机体功能紊乱的病理状态，在进行紧张激烈的运动时，血液中的儿茶酚胺水平升高，心肌需氧量增加，心脏负荷加重，同时机体水分蒸发快，血液黏稠度增高、血管内皮损伤，易出现血小板聚集和血栓形成，引起心肌严重缺血，导致猝死［6，13］。BECK 等［14］研究证实，高强度运动也会引起一系列炎症反应，大量炎症细胞浸润，从而导致机体各种疾病和损伤的发生。在消耗性体力活动期间，急性心肌梗死的风险暂时增加，在12 461例急性心肌梗死的患者中，在梗塞发作时有13.6%的病例处于体力活动，这点也提示力竭运动状态可能成为急性心肌梗死的诱因［13，15］。本研究发现Exh 组与Ctl 组和Res+Exh 组相比，斑块面积大于Ctl 组和Res+Exh 组，纤维帽厚度最薄，易损指数远远大于Ctl 组（P＜0.05），说明力竭运动可能诱导易损斑块破裂，增加斑块的不稳定性。

图1 3 组石蜡切片HE 染色病理结果Fig.1 Pathological results of HE staining of paraffin sections in three groups

图2 力竭运动和抗阻运动对易损指数的影响Fig.2 Effects of exhaustive and resistive exercises on the vulnerability index

已有研究报道抗阻运动使CHD 患者获益，增加骨骼肌质量和力量，提高基础代谢率，加强运动耐力［7-8］，改善胰岛素抵抗［11］。研究发现3 个月的有氧结合抵抗运动明显降低补体C1q/肿瘤坏子因子相关蛋白水平，抗阻运动在改善机体炎症水平方面优于有氧运动，可以通过降低机体血清炎症因子水平改善肥胖机体的慢性炎症状态。李良等［9-10］研究表明8 周有氧运动或抗阻运动训练通过提高大鼠肝脏FGF21 的蛋白表达水平促进了脂质代谢并在一定程度上减轻了肥胖大鼠的体质量，改善了血脂水平。研究［16-17］表明急性冠脉综合征患者心脏康复有氧运动后体质量减轻，肥胖BMI和腹围的管理与靶器官损害和预后有关。

本研究结果显示抗阻运动干预组体质量上升幅度较小，血脂水平低，可能与其调整血脂代谢，增加瘦体质量有关，这与上述研究具有一致性。叶城洁等［18］研究发现，力竭运动可以增加乙酰辅酶A 羧化酶的磷酸化水平，激活与脂质代谢相关的基因，分解脂肪酸，降低血脂。而张娜等［19］发现力竭运动导致小鼠脂质代谢紊乱，血清总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）和高密度脂蛋白（HDL-C）水平显著升高，而甘油三酯（TG）水平显著降低。ANTHONY 等［20］研究显示1年抗阻运动改善老年人血脂谱和降低乳糜微粒浓度。这与陈亚丽［21］抗阻训练有效改善老年超重及肥胖女性的慢性炎症状态及降低血脂结果一致。抗阻运动干预组的斑块面积最小、纤维帽厚度最大，易损指数最小说明其可能有稳定斑块的作用，究其原因可能与血脂水平改善有关。本研究结果显示Exh 组的血脂水平高于Res+Exh 组，这与张娜等研究结果力竭运动导致小鼠脂质代谢紊乱相吻合，同时说明抗阻运动降低血脂水平。

巨噬细胞在促进动脉粥样硬化的进展过程中发挥重要作用，活化的巨噬细胞吞噬LDL-C 形成泡沫细胞，聚集在斑块的纤维帽中，使斑块稳定性变弱，容易破裂［22-24］。巨噬细胞浸润和平滑肌细胞凋亡是斑块失稳的标志，本研究结果显示小鼠进行抗阻运动后，颈动脉斑块局部巨噬细胞的表达比力竭运动组少，平滑肌细胞的表达多于Exh组。抗阻运动可能通过抑制巨噬细胞浸润和平滑肌细胞凋亡从而起到稳定斑块的作用。

综上所述，力竭运动可诱导动脉粥样易损斑块破裂，抗阻运动可能起到稳定斑块的作用，可能与改善血脂水平、抑制巨噬细胞浸润和平滑肌凋亡有关，其机制值得进一步深入研究。