EV71对HFMD 患儿树突状细胞、MAPK 信号通路及炎性细胞因子的影响

宋丽，杨金玲

(1.郑州大学第三附属医院儿内科，河南 郑州 450052；2.济源市妇幼保健院儿科，河南 济源 454650)

手足口病 （hand foot mouth disease，HFMD）是临床上较为常见的儿童流行疾病,相关临床随访研究显示,临床上HFMD的发病率可达234~56 6/1万人左右,在部分大流行或者爆发的地区,HFM D的发病率更高[1,2]。

肠道病毒EV71型是导致HFMD感染的重要病原体，对于肠道病毒EV71型引起的相关HFMD患儿致病机制的研究,能够为临床上HFMD的生物学治疗提供理论基础。肠道病毒EV71型能够通过对树突状细胞（DCS）的激活,诱导体内T淋巴细胞或者体液免疫功能的恢复,并通过激活p-p38 MAP K、p-JNK和p-ERK1/2相关信号通路蛋白的上升，促进MAPK下游相关因子的激活,加剧不同的炎症细胞对于皮肤黏膜的损害[3-5]。已有的相关研究揭示了肠道病毒EV71型的感染与HFMD患儿不良临床结局的关系，但缺乏对于肠道病毒EV71型在HFMD发病机制过程中的相关生物学机制的研究。为了进一步揭示肠道病毒EV71型在促进HFMD患儿病情进展过程中的作用,本次研究选取2016年2月至2017年3月在我院住院治疗的HFMD患儿64例，探讨了肠道病毒EV71对DCS细胞的激活及对于体内细胞炎症因子的上调作用,报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年2月至2017年3月在我院住院治疗的HFMD患儿64例，其中男35例，女29例；年龄8个月～5岁，平均年龄（2.01±0.97）岁；轻症 38例（轻症组），重症 26例（重症组）；纳入标准：⑴诊断符合卫生部《手足口病诊疗指南（2010 年版）》和《肠道病毒 71 型（EV71）感染重症病例临床救治专家共识（2011年版）》中标准；⑵实验室明确为肠道病毒EV71型感染；⑶年龄≤5岁；⑷患儿监护人知情同意。排除标准：⑴有肾病综合征、免疫系统性疾病等慢性基础性疾病；⑵先天性心脏病或肺发育不良者；⑶长期服用糖皮质激素者。同时选取健康儿童60例作为对照组，各组受试者性别、年龄比较差异无统计学意义 （P＜0.05），见表 1。

1.2 实验方法

表1 各组一般资料比较

1.2.1 DCs分离、培养 收集30ml外周血，裂解外周血血浆中红细胞，离心获得单个核细胞，于青霉素、37℃、5%二氧化碳条件下培养,加入100mg/dl的集落刺激因子，50mg/dl的IL-4促进DCs的分化。培养第6d后，收集细胞，调整浓度为1×109cells/L。

1.2.2 表面标志物细胞数检测 采用流式细胞仪双标法分别对CD80和CD83以及CD86和CD11c进行检测，荧光标记分别为CD80-PE/CD83-FITC，CD86-PE/CD11c-FITC,操作于5ml试管中进行,100μl DCs细胞与 CD80和 CD83(CD86和 CD11c)荧光标记抗体室温反应25min,采用红细胞裂解液optiLYse C溶血素溶解红细胞，PBS液体洗涤三遍,每次5min,生理盐水重新悬浮细胞,上机检测。(FACS calibur流式细胞仪购自美国BD公司）。

1.2.3 MAPK信号通路蛋白检测 冰上分离细胞蛋白,冰上静置60min,室温下20000r/min离心60 min，取出下层沉淀。按总蛋白80斗g计算上样容积,按照比例为3：1或者4：1的比例上TBS缓冲液，加入20μl缓冲液后于45 V电压下进行电泳操作,脱脂蛋白封闭2h，加入p-p38 MAPK、p-JNK和p-ERK1/2抗体（鼠来源抗体，购自上海碧云天生物技术有限公司）各10μl后室温下孵育2h，2h后加入二抗，室温孵育1h（兔来源抗体，购自南京凯基生物科技有限公司）。采用日本panasoic公司的HSO-900系统影像分析仪器进行图像分析。

1.2.4 炎性细胞因子检测 收集DCs细胞上清液，1000r/min离心5min，采用生物酶联免疫吸附法检测相关指标，IL-6和TNF-a、IL-12检测试剂盒购自罗氏生物检测应用公司,配套试剂及仪器购自南京伯斯金生物科技有限公司。

1.3 统计学处理 统计分析采用SPSS19.0软件，计量资料采用（)表示，多组间比较使用方差分析，两两比较采用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组DCs表面标志物检测结果比较 重症组CD80和 CD83明显高于轻症组和对照组 （P＜0.05）；轻症组CD80和CD83明显高于对照组（P＜0.05）；三组CD86和CD11c比较差异无统计学意义（P＞0.05）。说明EV71感染可诱导DC趋向成熟。见表2、表3和图1。重症组中死亡和非死亡患儿CD80、CD83、CD86和CD11c比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表 4。

表2 各组DCs表面标志物检测结果比较

表3 各组DCs表面标志物检测结果比较(平均荧光强度)

表4 重症死亡和非死亡患儿DCs表面标志物检测结果比较

表5 重症死亡和非死亡患儿DCs表面标志物检测结果比较(平均荧光强度)

2.2 各组MAPK信号通路相关蛋白比较 重症组p-p38 MAPK、p-JNK和p-ERK1/2表达显著高于轻症组和对照组（P＜0.05）；轻症组 p-p38 MAPK、p-JNK和p-ERK1/2表达显著高于对照组 （P＜0.05）；说明EV71感染可激活MAPK信号通路。见表6和图2。重症组中死亡和非死亡患儿p-p38 MAPK、p-JNK和p-ERK1/2表达比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表 7。

图1 各组DCs表面标志物检测结果图

表6 各组MAPK信号通路相关蛋白比较

表7 重症死亡和非死亡患儿MAPK信号通路相关蛋白比较

图 2 Western blot法检测图（1：对照组；2：轻症组；3：重症组）

2.3 各组炎性细胞因子比较 重症组IL-6显著高于轻症组和对照组（P＜0.05）；重症组TNF-显著高于对照组，但低于轻症组（P＜0.05）；轻症组IL-6和TNF-显著高于对照组（P＜0.05）；三组 IL-12 比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表8。重症组中死亡患 IL-6 为（80.42±9.28）pg/ml，明显高于非死亡患儿（P＜0.05），而 TNF-为（24.02±6.10）pg/ml，明显低于非死亡患儿（P＜0.05），见表 9。

表8 各组炎性细胞因子比较

表9 重症死亡组与非死亡组炎性细胞因子比较

3 讨论

手足口病的病因相对复杂,虽然肠道病毒EV 71以及科萨奇病毒科相关亚组病毒的感染可以导致明显的肠道局部黏膜腺体以及全身循环系统表现，特别是明显的神经系统受累表现，但其具体作用机制无法确定。轻症手足口病患儿的预后较好，多数可在一周内自愈，而重症患儿的发病较急、化脓性脑膜炎以及脑实质受累的表现可在3~6h内引起明显的脑膜刺激症状，进而引起呼吸循环功能衰竭[6,7]。现阶段临床上不同的方式治疗HFMD的临床总体有效率较低，治疗后的病情缓解率不足35%[8]，而通过对于HFMD发病过程中相关分子机制或者生物学机制的研究,具有下列几个方面的现实意义：⑴能够为临床上HFMD患儿的早期疾病诊断或者临床预后评估提供参考；⑵能够为临床上HFMD患儿的治疗提供理论基础,特别是通过对于信号通路受体拮抗剂的相关研究,能够为HFMD的治疗提供潜在的参考。

DCS细胞是体内重要的抗原提呈细胞,其能够通过促进相关下游CD4T淋巴细胞或者CD8T淋巴细胞等的激活，提高患儿局部细胞免疫功能，改善患者的临床预后[9,10]。DCS的表达或者细胞浓度的维持，能够为感染性疾病的免疫屏障的维持、提高病原体的吞噬效果等提供帮助[11,12]。MAPK信号通路不仅能够在影响到恶性肿瘤的发生过程中起到一定的作用,同时还可以在促进氧化应激反应、提高炎症反应的损伤程度,加剧自然杀伤性T淋巴细胞的自身细胞毒性作用等,促进皮肤黏膜组织或者重要内脏器官组织的损伤[13]。

CD80和CD83是评估DCS细胞成熟程度的重要细胞表面抗原,其表达浓度的上升往往提示DCS细胞的成熟，T淋巴细胞免疫活性的提升[14,15]。本次研究中可以发现的是病例组患者血清中相关抗原指标均明显高于对照组,其中重症组患者的相关指标表达高于轻症组,而轻症组患者高于正常对照组，差异具有统计学意义,这些均提示了肠道病毒EV71对于DCS的分化成熟作用,这从机制上考虑可能与下列几个方面的因素有关：⑴肠道病毒E V71能够促进单核细胞或者巨噬细胞表面抗原表位的释放,通过正反馈机制促进CD80或者CD8 3的表面抗原的浓度的维持。CD86和CD11c等是评估DCS细胞另一重要表面抗原,但本次研究中并未发现相关指标的上升,提示肠道病毒EV71并不能对于全部的DCS表面抗原均具有一定的协同刺激作用。冯爱东等[16]在探讨了36例样本量的重症HFMD患者的血清学资料后发现,肠道病毒EV71能够提高25%～65%左右的CD80的表达阳性率，且肠道病毒EV71的感染时间越长、病原体扩增速度越快，CD80的阳性率越高。重症组p-p38 MAPK、p-JNK和p-ERK1/2相关蛋白水平的表达均有所上升,高于轻度组或者对照组,提示MA PK信号通路的激活在促进HFMD的病情进展过程中具有显著的作用，而肠道病毒EV71可能在影响到MAPK信号通路的上调方面发挥了一定的作用，这主要考虑与肠道病毒EV71对于MAPK信号过程中JNK蛋白的转录或者上游相关启动子的调控增强有关。但是在重症组中死亡和非死亡患者中，并非发现MAPK信号通路蛋白或者CD80等表面抗原的表达差异,提示相关分子生物学因子并不能作为临床上评估不同临床预后的差异性指标。最后,本次研究发现重症组IL-6的高表达及TNF-a的表达波动等，均能够影响到下游炎症细胞的浸润，促进皮肤黏膜的损伤，加大病死率的发生。

综上所述，EV71可促进CDs细胞成熟,激活MAPK信号通路,促进部分炎性因子释放；患儿预后与CDs及MAPK信号通路未见明显联系。