诺沃霉素对西瓜立枯病的防治效果

黄大野 方 伟 万中义 张亚妮 杨 丹 郑娇莉 姚经武 王开梅 周荣华 李金萍 曹春霞*

（1 湖北省生物农药工程研究中心，湖北武汉 430064；2 北京市植物保护站，北京 100029）

我国是全球西甜瓜生产与消费第一大国，2017年全国西瓜播种面积 152 万hm2，总产量6 314.7 万t（农业农村部，2019）。由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的西瓜立枯病是西瓜苗期的一种重要病害（Mirmajlessi et al.，2012），西瓜感染立枯病后表现出烂种、幼苗死亡、茎萎缩、根和果实腐烂，从而引起植株死亡和减产（Aiello et al.，2012）。化学防治是防治西瓜立枯病的主要手段，但化学杀菌剂的长期使用会造成环境污染和生态的破坏，同时，使用单一杀菌剂必然会引起抗药性。因此，需要开发更为安全有效的防治药剂（于冰 等，2011）。诺沃霉素是由湖北省生物农药工程研究中心分离和鉴定的全新结构的32 元环大环内酯抗生素，对多种植物病原真菌具有良好的抑菌活性。笔者前期对诺沃霉素杀菌活性的研究多集中于叶面喷雾防治气传病害上（黄大野 等，2018，2019），本试验首次通过浸种方式防控土传病害，探讨诺沃霉素作为种子处理剂的应用潜力。诺沃霉素有A 和B两个结构，A 和B 结构相似，抑菌效果相当（黄大野 等，2018，2019），故本试验只选取诺沃霉素A对西瓜立枯病的防治效果进行研究，为诺沃霉素在防治西瓜立枯病的田间应用和推广方面奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：立枯丝核菌（R.solani）由湖北省生物农药工程研究中心分离和保存，为多菌灵敏感菌株。

供试药物：诺沃霉素A 原药（含量95%），98%多菌灵原药（安徽广信农化股份有限公司）。

西瓜品种为春秋花王，从湖北蔬谷农业科技有限公司购种。

室内试验于2017 年4 月在湖北省生物农药工程研究中心进行。

1.2 试验方法

1.2.1 诺沃霉素A 对立枯丝核菌的抑菌活性 将立枯丝核菌从斜面活化至PDA 培养基，28 ℃培养4 d 备用。将诺沃霉素A 原药加入母液体积1%的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解，随后加入无菌水配制成100 μg·mL-1母液备用。采用梯度稀释法对诺沃霉素A 进行稀释，使其在PDA 培养基的终浓度为10、5、2.5、1.25 μg·mL-1和0.625 μg·mL-1。多菌灵母液配制方法同诺沃霉素A，多菌灵在PDA 平板终浓度为1、0.5、0.25、0.125 μg·mL-1和0.062 5 μg·mL-1。每个浓度设置3 次重复，以加入含1% DMF 无菌水作为对照。用4 mm打孔器打取立枯丝核菌菌饼接入PDA 平板中央，28 ℃黑暗培养3 d，用十字交叉法测量每个培养皿内菌落直径，用 DPS 软件求出诺沃霉素A 和多菌灵对立枯丝核菌生长的毒力回归方程和抑制中浓度EC50。

菌丝生长抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%

将含10 μg·mL-1诺沃霉素A 的PDA 平板平铺灭菌玻璃纸，随后在平板中央转入立枯丝核菌菌饼，以加入1%DMF 无菌水作为对照。培养36 h 后用无菌刀片挑取菌落边缘菌丝置于载玻片，用40倍光学显微镜（OLYMPUS CX21，Tokyo，Japan）观察处理和对照菌丝形态。

另将上述培养菌丝用2.5%戊二醛固定，4 ℃过夜，参照康振生（1995）的方法，在扫描电镜下观察处理和对照菌丝形态。

1.2.2 诺沃霉素A 对立枯丝核菌菌核形成的影响 按照1.2.1 的方法，将诺沃霉素A 配制成2.5、1.25、0.625 μg·mL-1和0.312 5 μg·mL-1浓 度 的PDA 平板，接入立枯丝核菌菌饼，在28 ℃继续培养，待对照长出大量菌核后，记录菌核数量并用电子天平测定每个平板产生的所有菌核质量，每个处理3 次重复，以加入含1% DMF 无菌水作为对照。

1.2.3 诺沃霉素A 浸种防治西瓜立枯病的盆栽试验 盆栽试验于2017 年7 月在湖北省农业科学院温室内进行。将活化好的立枯丝核菌块置于PDB培养基中静置培养7 d，取出菌丝用无菌水冲洗干净，用电子天平测定质量后用组织打碎机打碎。将菌丝按每千克基质土3 g 菌丝的比例均匀拌入基质土中备用（黄新琦 等，2012），基质土配比为草炭∶蛭石∶珍珠岩=3V∶1V∶1V。按照1.2.1 的方法将诺沃霉素A 和多菌灵分别配制成4 000 μg·mL-1和1 000 μg·mL-1溶液。将西瓜种子用上述2 种药剂浸种2 h 后播入带菌土中，以1% DMF 无菌水浸种的处理作为对照，以1% DMF 无菌水浸种且播入不含立枯丝核菌的上述基质土的处理作为空白对照，试验设 3 次重复，每个重复 72 粒种子，温室常规培养。10 d 后统计各处理出苗数，并计算防效。

发病率=（播种种子数量-正常苗数量）/播种种子数×100%

防治效果=（对照发病率-处理发病率）/对照发病率×100%

1.3 数据分析

试验数据使用SPSS 13.0（SPSS，USA）软件进行统计学分析。采用单因素方差分析及LSD 多重比较法对不同处理下菌核数、菌丝质量、发病率和防效进行差异显著性分析，采用独立样品T 检验对不同处理下防效进行差异显著性分析，所有统计分析以P＜0.05 为差异显著性标准。

2 结果与分析

2.1 诺沃霉素A 对立枯丝核菌的抑菌活性

室内抑菌试验表明，诺沃霉素A 对立枯丝核菌菌丝生长具有强烈的抑制作用，各试验浓度对立枯丝核菌均具有一定的抑菌作用，抑菌作用随浓度降低而下降（图1）。抑制中浓度为1.726 0 μg·mL-1，对照药剂多菌灵抑制中浓度为0.234 7 μg·mL-1，诺沃霉素A 的抑菌活性略低于对照药剂（表1）。

图1 诺沃霉素A 对立枯丝核菌离体抑菌效果

表1 诺沃霉素A 对立枯丝核菌的抑菌活性

经10 μg·mL-1诺沃霉素A 处理后，通过光学显微镜观察，与对照相比，立枯丝核菌菌丝发生断裂、扭曲和变形（图2）；扫描电镜观察显示，与对照相比，立枯丝核菌菌丝表面出现干瘪、塌陷和扭曲皱缩（图3）。

2.2 诺沃霉素A 对立枯丝核菌菌核形成的影响

诺沃霉素A 能有效抑制立枯丝核菌菌核的产生，其中2.5 μg·mL-1和1.25 μg·mL-1能完全抑制菌核的产生（表2）。

图2 显微镜下诺沃霉素A 对立枯丝核菌菌丝生长的影响（物镜40 倍）

图3 扫描电镜下诺沃霉素A 对立枯丝核菌菌丝生长的影响

2.3 诺沃霉素A 对西瓜立枯病的防治效果

在活体盆栽条件下，诺沃霉素A 和多菌灵浸种处理均能有效防治西瓜立枯病。4 000 μg·mL-1诺沃霉素A 对西瓜立枯病防效为91.83%，1 000 μg·mL-1多菌灵对西瓜立枯病防效为95.20%。在试验浓度下诺沃霉素A 与多菌灵的防效均达90%以上（表3）。

表2 诺沃霉素A 对立枯丝核菌菌核形成的影响

表3 诺沃霉素A 浸种防治西瓜立枯病盆栽效果

3 结论与讨论

本试验通过生长速率法测定诺沃霉素A 对担子菌立枯丝核菌EC50为1.726 0 μg·mL-1，于冰等（2011）报道了一种核苷类抗生素丰加霉素对黄瓜立枯丝核菌EC50为1.670 μg·mL-1，两种抗生素对立枯丝核菌的抑菌活性相似。之前研究表明，诺沃霉素A 对灰葡萄孢（Botrytis cinerea）和茶拟盘多毛孢（Pestalotiopsis theae）EC50分别为0.631、2.110 μg·mL-1，其对立枯丝核菌杀菌活性介于两者之间（黄大野 等，2018，2019）。

立枯丝核菌主要以营养菌丝体和菌核形式存在（Zheng et al.，2013），立枯丝核菌的病害循环对于病害的防治至关重要，本试验结果表明，诺沃霉素能有效抑制立枯丝核菌的菌丝生长和菌核产生，对于西瓜枯萎病的田间防治至关重要。1.25 μg·mL-1诺沃霉素A 能完全抑制菌核的产生，而2.20 μg·mL-1丰加霉素浓度下才能完全抑制菌核产生（于冰 等，2011）。

种子处理和喷淋苗床是防治作物苗期病害的两种主要施药方式（杨宇红 等，2015；宋顺华 等，2017），盆栽试验结果表明，4 000 μg·mL-1诺沃霉素A 浸种对西瓜立枯病防效为91.83%，而喷淋苗床等施药方式对西瓜立枯病的防治效果需要进一步研究。由于盆栽试验和田间试验具有一定差异，诺沃霉素A 对西瓜立枯病的田间防治效果还需要进一步验证。同时，还需要对诺沃霉素A的抗性风险、田间使用剂量等进行更深入的研究，为诺沃霉素A的田间应用和推广奠定基础。