小鼠CD147过表达对皮肤毛发生成和创伤修复的影响*

胡兴旺，谢雅琳，龙娟，周磊，陈旺青，邓智利

（中南大学湘雅医院 1.感染病科/病毒性肝炎湖南省重点实验室；2.皮肤科/银屑病湖南省重点实验室，湖南 长沙 410008）

CD147（cluster of differentiation 147）又名细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN），是免疫球蛋白超家族的一种多重糖基化修饰的单次跨膜蛋白，相对分子质量约50～60 kDa［1］。CD147 于心血管系统、神经系统、免疫系统和皮肤等器官中的多种细胞中广泛表达；也可以通过剪切从细胞膜脱落下来，或通过微囊泡分泌从而游离进入组织液和血液［2］。作为1 型整合膜受体，可以与亲环素、PfRh5、整连蛋白等结合，参与细胞间的识别、免疫调节、器官发育、病毒感染等多种生物学过程［3］。例如：CD147 可以通过核转录因子-kB（nuclear transcription factor kappa B, NF-kB）信号通路调节α4 整连素表达从而影响免疫细胞的黏附和识别［4-5］。通过调节下游基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）基因，在精子发生过程中影响生殖细胞的迁移、生存或凋亡［6］，通过调节单羧酸转运体（monocarboxylate transporters,MCTs）影响乳酸转运［7］。

在肿瘤中，CD147 与多种肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌等的发生、发展、病理分级、治疗预后密切相关。其机制主要涉及3 个方面，首先CD147 作为MMPs 上游强力诱导因子作用于整合素α3β1、丝裂原活化蛋白等，极大提高MMPs 酶的水平和活性，提高基底膜和细胞外基质降解速率，大幅促进肿瘤的增殖和侵袭［8］。其次，它可通过PI3K-AKT 等多种途径诱导血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）产生，促进肿瘤血管生成［9］。最后可以通过调节糖酵解等代谢途径促进肿瘤的发生［10］

CD147 在皮肤细胞尤其是表皮角质形成细胞中高表达，CD147 在白细胞介素22（interleukin 22, IL22）诱导的皮肤银屑病［11］、系统性红斑狼疮［12］中起关键作用。在皮肤肿瘤中，CD147 可通过调节葡萄糖转运，参与黑色素瘤细胞生存和增值［13］。抑制CD147 后可以降低胰岛素样生长因子结合蛋白 2 （insulin-like growth factor binding protein 2,IGFBP2）表达从而诱导黑色素瘤细胞的凋亡［14］。细胞核定位的CD147 可以通过与RING1相互作用抑制其转录活性从而抑制黑色素瘤细胞的迁移能力［15］。TRAF6 可以通过抑制CD147 的泛素化，促进其在细胞膜上的招募和定位［16］，从而参与表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor,EGFR）信号通路激活［17］，促进了黑色素瘤细胞的侵袭和转移能力。因此诸多证据都提示抑制 CD147 可以作为开发新的黑色素瘤治疗策略的靶标基因［18］。

最新研究表明 CD147 与干细胞存在密切联系，如 CD147 可被人胚胎干细胞抗体识别，是干细胞的潜在标志基因［19］。有证据证实，CD147 的表达水平与角质形成细胞的分化程度呈负相关［20］。干扰 CD147 表达后，皮肤角质细胞分化标志基因角蛋白 keratin10 表达上调［21］。笔者的前期研究发现CD147 的表达与毛囊活动相关，提示CD147 可能在皮肤毛发生成和皮肤干细胞稳态中扮演重要角色，因此本研究构建了 CD147 过表达小鼠，并对CD147过表达后的小鼠皮肤毛发生成和皮肤创伤修复能力进行了观察，研究结果显示 CD147 改变毛发形成的模式，并削弱皮肤创伤修复能力。这一研究为更好地理解和阐明 CD147 在皮肤中的功能提供了现实依据，也为开发以 CD147 为靶标的皮肤外用药物提供理论指导。

1 材料和方法

1.1 实验材料

CD147 抗体 （货号 sc-9757） 购自 Santa Cruz,CD34+抗体（货号 14-0349-82）购买自 eBioscience,DAPI （货号 28718-90-3）、BrdU （货号 19-160）和抗 BrdU 抗体 （货号 B8434） 购自 Sigma。荧光二 抗 Alexa Fluor®488 （货 号 A-10684）、 Alexa Fluor®555 （货号 A-21432）购买自 Invitrogen。

CD147 过表达转基因小鼠委托上海南方模式动物所构建，采用受精卵注射随机插入的技术方案将外源 CAG 启动子驱动的鼠源 CD147 基因片段导入小鼠中，经过鼠尾 DNA 提取和聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR） 法鉴定筛选建系，获得全身稳定过表达 CD147 小鼠品系。动物繁殖与试验在中南大学实验动物中心进行，所有操作均经过中南大学湘雅医院伦理委员会审批并遵从相关动物伦理条例。

1.2 实验方法

1.2.1 体重、身长测量 小鼠出生开始，每天使用托盘天平进行称重，并使用软尺测量身长增长情况（鼻尖至尾尖）。16 d 测量完毕后，取鼠尾提取 DNA，进行 PCR 基因型鉴定，并依照鉴定结果对测量数据进行分类和分析。

1.2.2 皮肤组织石蜡包埋和 HE 染色 取 0.5 cm2背部皮肤组织，4% 多聚甲醛固定 24 h，按照标准程序经过梯度乙醇脱水、透蜡后石蜡包埋，组织切片机中0.8 m 厚度切片。组织薄片摊片机展开后吸附于阳离子处理的载玻片上，晾干保存。HE 染色前，取出60℃烘烤2 h，二甲苯或松节油脱蜡2 次每次10 min，梯度乙醇复水后苏木素溶液染色数分钟，流水适当冲洗后氨水反蓝，随后梯度酒精脱水伊红染色1 min，无水乙醇清洗后二甲苯透明，最后中性树脂封片，显微镜下观察并拍照。

1.2.3 小鼠多轮脱毛 小鼠脱毛后干细胞激活，7 d后小鼠毛发完全进入生长期。21 d 后进入静息期。因此以28 d 为一个周期，对实验小鼠进行9 轮脱毛。小鼠经麻醉后，使用毛刷按照小鼠背部毛发生长方向将融化的液态石蜡均匀地刷布于整个背部。室温冷却约3 min 后石蜡凝固，从尾部开始逆毛发生长方向轻轻撕扯，背部毛发即可随石蜡剥脱。如局部毛发脱不干净，可重复以上操作一次。

1.2.4 创伤实验 小鼠腹腔注射麻醉剂麻醉后，按照上述方法对背部皮肤进行脱毛，随后使用酒精和络合碘清洁消毒裸露皮肤。使用6 mm 直径孔径打孔器进行创伤造口。最后分别于创伤造口之后的1，3，5，7，9，11 d 使用游标卡尺对皮肤伤口直径进行测量并统计分析，非圆形伤口直径定义为（长+宽）/2。

1.2.5 冷冻切片与免疫荧光染色 采集0.5 cm2小鼠皮肤组织，PBS 洗净后浸入OCT 冰冻包埋剂中平衡5 min。转移到0.2 mm 中性滤纸上展平，随后在制作好的模具中OCT 冷冻包埋。Leica CM1520 冷冻切片机行10 μm 厚度切片，展片后阳离子载玻片吸附，-80℃保存。免疫荧光染色时，取出冷冻切片，用4%多聚甲醛室温固定15 min，随后0.2% TritonX-100 室温通透20 min，PBS 浸洗，正常山羊血清室温封闭、依次孵育目标蛋白一抗和针对性荧光二抗，并中间洗涤。使用DAPI避光复染细胞核，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片后，在荧光显微镜下观察并采集图像。

1.3 统计学方法

本研究所有数据均采用Prism 6.0 软件进行统计分析，显著性差异采用Student's T-test 进行校验，P＜0.05 为差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 CD147 过表达对小鼠生长发育和皮肤结构无显著影响

为了从整体上观察CD147 对小鼠有何影响，构建 CD147 过表达小鼠后，对鉴定阳性的小鼠基础表型进行了观察。结果显示 CD147 基因的过表达小鼠外观、体型、行为模式与野生型（wild type,WT）小鼠无明显差异。通过对出生后体重和身长发育情况进行逐天测量，测量数据进行回归统计分析绘制时间曲线 （图1A）。结果显示，过表达小鼠在体重增长和身高（身长）增长上与野生型小鼠无显著差异。随后取 8 周龄离乳小鼠皮肤，组织经固定后，石蜡包埋并切片进行 HE 染色（图1B），结果显示皮肤结构上两者亦无显著差异。这一结果证明 CD147 基因的过表达并不影响动物的早期发育和皮肤结构形成。

2.2 CD147 过表达影响小鼠毛发类型分布

小鼠毛发的形态包括三类，分别为粗大直立型的刚直毛（Guard 型毛，以下简称 G），形似括号的弧线形毛（Bow 型毛，以下简称 B）和具有多个弯曲转折的 Z 字型绒毛（Zigzag 型毛，以下简称Z）。笔者对模型小鼠皮肤毛发进行了取样分析，取 1、5、8 个月龄小鼠，背部随机拔取 3 撮毛发，在奥林巴斯体式显微镜和 DP80 成像分析系统下对毛发样本进行分类计数和长度测量，结果如图2所示，CD147 过表达小鼠与同窝野生型小鼠毛发相比，内部环状结构排列偏混乱 （图2A），但各类型毛发长度差异无统计学意义 （图2B），其长度-年龄曲线（图2C）显示 CD147 过表达后毛发偏短，但是随着年龄增大逐渐无差异，提示着CD147 可能对维持毛囊长期稳态有一定影响。毛发类型分类统计显示各型毛比例变化，刚直毛数量减少，Z 型绒毛比例增多（图2D），提示 CD147可能在毛发形成中具有作用。

2.3 多轮脱毛后 CD147 过表达小鼠毛发相对野生型稀疏

为了进一步观察 CD147 过表达对毛囊和毛发的影响，笔者采取了多轮石蜡脱毛的方法 （图3A）造成毛囊损伤，刺激毛囊激活，反复进入生长期。对脱毛后小鼠拍照，并取脱毛后 0、2、7 d小鼠皮肤组织，冷冻切片和 Ki67 免疫荧光染色观察毛囊细胞增殖情况，结果显示从脱毛后2d开始毛囊中细胞增殖标记基因 Ki67 表达开始激活，到7 d 达到高峰（图3B）。经过 9 轮脱毛刺激后，皮肤镜扫描显示 CD147 过表达小鼠相对于野生型对照毛发更稀疏（图3C），提示 CD147 过表达降低皮肤毛发再生能力。

图1 CD147 过表达小鼠生长发育情况和皮肤结构观察

图2 CD147 过表达小鼠毛发分类观察

图3 多轮脱毛降低CD147 过表达小鼠毛发密度

2.4 多轮脱毛后CD147 过表达小鼠创伤愈合能力降低

接下来笔者观察了野生型（WT） 小鼠和CD147 过表达小鼠多轮脱毛后皮肤创伤愈合能力的改变。使用6 mm 直径创伤打孔器进行创伤。并分别在创伤之后的第3，5，7，9，11 d 对小鼠背部伤口进行观察和测量（图4A）。伤口直径相对于初始直径（6 mm）计算出修复百分比，并对各时期CD147过表达组和对应对照组数据进行t检验。统计结果如图4B所示，相对于野生型小鼠，多轮脱毛后的CD147过表达小鼠的皮肤创伤修复减慢。

图4 多轮脱毛后 CD147 过表达小鼠创伤修复能力降低

2.5 CD147 过表达促进皮肤干细胞激活和毛囊细胞增殖

为了从分子水平上更好地分析多轮脱毛对皮肤毛囊的影响，笔者收集多轮脱毛后的小鼠皮肤组织，进行冷冻切片后皮肤干细胞的标志基因CD34 免疫荧光染色。结果如图5A 所示，经过多轮脱毛后，相对于野生型WT 对照，CD147 过表达小鼠在皮肤局部毛囊中CD34 阳性的细胞更多，提示皮肤干细胞被激活增殖，数量增加。同时通过腹腔注射小分子标记物BrdU（5 mg/kg）后，1 h后收集皮肤，同样冷冻切片并使用BrdU 抗体免疫荧光染色，结果显示多轮脱毛后相对于野生型WT对照，CD147 过表达小鼠在皮肤局部单个毛囊中细胞增殖更加活跃（图5B）。

图5 免疫荧光检测脱毛后小鼠皮肤

3 讨论

CD147 是一个多功能分子，在胚胎发育、神经系统功能、损伤修复、炎症发生、肿瘤进展等多种生理病理过程中均发挥重要作用。它作为一个细胞表面受体糖蛋白，在皮肤角质细胞中强表达，并定位于细胞膜。然而它在皮肤毛囊中的作用目前仍然少见报道。有证据表明CD147 在皮肤毛囊根部毛球区和隆突区高表达［22］，与毛囊干细胞分布区域重叠。毛囊干细胞在皮肤毛发再生、创伤修复和皮肤稳态维持中起重要作用，其分裂和增值分化形成新的皮肤角质形成细胞，对于维持皮肤屏障功能至关重要。在毛发的生长和消退周期中，皮肤干细胞也周期性地激活和短暂扩增。笔者的研究数据证实CD147 过表达后，可促进皮肤中干细胞的激活和细胞增殖，提示CD147 表达对于皮肤毛囊干细胞具有调控作用。它的过表达可以引起皮肤毛发形成的改变。然而为何CD147过表达后皮肤毛囊干细胞增殖增加，皮肤创伤的修复能力反而降低呢？笔者推测多轮脱毛后，毛囊和其中的干细胞反复激活，在CD147 的作用下，这种长期的增加增殖可能加速了皮肤干细胞的耗竭，最终导致毛囊数量的减少，毛发变稀疏。而干细胞的耗竭最终导致了皮肤修复功能的减弱。

然而CD147 通过什么途径来调节和影响皮肤干细胞功能仍然有待进一步挖掘，有线索表明，CD147 定位于线粒体内膜，可能参与调解呼吸代谢作用。并且CD147 可以通过Glut1［13］、MCT4［10］等途径调控细胞糖酵解。由于皮肤干细胞通过减少有氧呼吸来达到降低氧化水平、保护遗传物质、降低氧化损伤和维持细胞自我更新。因此笔者推测CD147 可能通过调节能量代谢的方式来影响皮肤干细胞的数量和功能。

当然本研究也存在不少局限之处，首先，作为表型观察研究，对于CD147 如何调节毛囊干细胞的潜在分子机制挖掘不够深入；其次，统计标本量和实验动物数量有限，可能存在一定抽样偏差。最后，作为CD147 过表达小鼠模型，与人体真实生理状况存在一定差异，因此CD147 与毛囊的关系及其过表达后在人体内真实生理状态变化仍需进一步研究确认。

CAG 启动子是一种由人工构建的广谱表达的组合启动子，由巨细胞病毒（cytomegalovirus,CMV）早期增强子和鸡β-肌动蛋白启动子组成，其驱动的外源基因可表达于小鼠各组织细胞。笔者构建的CAG-CD147 过表达小鼠经过验证，可在皮肤细胞中维持高水平CD147 表达。因此，综上所述，通过观察CD147 过表达后毛发的生成、多次脱毛后毛发的再生情况、创伤的愈合和皮肤毛囊干细胞的激活，笔者发现并证明CD147 过表达后，可能促进皮肤中干细胞的激活和细胞增殖，这种长期的激活可能加速了皮肤干细胞的耗竭，最终导致毛囊数量的减少，毛发变稀疏和皮肤修复功能的减弱。这一研究不仅为理解和阐明CD147 在皮肤中的功能提供了现实依据，也为开发以CD147 为靶标的皮肤外用药物提供理论指导。