黄连素对脂多糖诱导人脐静脉血管内皮细胞损伤的保护作用研究

王丽君 包贝贝 郭君平 华燕吟

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是众多心脑血管疾病的共同病理生理基础[1]，而血管内皮细胞损伤是AS发生的重要原因[2]。研究表明，细胞自噬在维持心血管系统稳态和血管内皮功能方面至关重要[3]。正常的细胞自噬可以通过减轻炎症水平、影响内皮一氧化氮合酶等途径来保护血管内皮细胞，维持心血管系统的稳态[4]；但细胞自噬受损或过度时可导致细胞功能障碍，促进AS 的发生和进展[5]。目前细胞自噬作为AS 潜在治疗靶点受到越来越多的关注。在之前的研究中，本团队发现黄连素（berberine，BBR）能通过c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信号通路对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）起保护作用[6]。由于JNK 信号通路与细胞自噬关系十分密切[7]，而异常的细胞自噬可能是AS 的启动因素，因此本研究通过LPS 诱导HUVECs 建立血管内皮炎症损伤模型，观察BBR 在LPS 诱导的HUVECs 损伤后细胞自噬中的作用，以期为BBR 在抗AS 治疗的临床应用中提供更多的理论和实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料 HUVECs 购自上海奥赛尔斯生物技术有限公司；BBR、LPS、雷帕霉素（rapamycin，RAPA）和3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA） 均购自美国Sigma 公司；DMEM/F12、10%FBS 均购自美国Gibco 公司；自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）购自上海汉恒生物科技有限公司；5-溴-2-脱氧尿嘧啶（EdU）试剂盒、RIPA 裂解液、考马斯蓝染色蛋白浓度测定试剂盒均购自江苏碧云天生物技术有限公司；兔抗人p62 抗体、兔抗人LC3 抗体及辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔二抗均购自英国Abcam 公司。

1.2 方法

1.2.1 HUVECs 的培养、分组和处理 细胞培养：HUVECs 复苏后用含有5U/ml 肝素、2mmol/L L-谷氨酰胺，100U/ml 青霉素、10μg/ml 链霉素、50μg/ml 内皮细胞生长添加物和10%FBS 的DMEM/F12 培养基培养，置于37℃、5%CO2培养箱中贴壁培养，待细胞生长至80%融合度时，用0.25%胰酶（含0.02%乙二胺四乙酸）消化传代，倒置光学显微镜观察细胞的生长，待细胞状态稳定后用于实验。实验分组和处理：（1）正常对照组（Control组）：不予特殊处理；（2）LPS 组：只给予LPS 20μg/ml；（3）LPS+RAPA 组：以细胞自噬诱导剂RAPA 100nmol/L 预处理30min 后再给予LPS 20μg/ml 刺激；（4）LPS+3-MA组：以细胞自噬抑制剂3-MA 5mmol/L 预处理30min 后再给予LPS 20μg/ml 刺激；（5）LPS+BBR 组：BBR 10μM 预保护培养24h 后再给予LPS 20μg/ml 刺激。Control 组、LPS 组、LPS+RAPA 组和LPS+3-MA 组4 组细胞相互比较，观察调控细胞自噬水平对细胞损伤的影响；Control组、LPS 组和LPS+BBR 组3 组细胞相互比较，观察BBR的保护作用及其对细胞自噬的影响。

1.2.2 细胞活性检测 采用EdU 染色法。取对数生长期的HUVECs，制备单细胞悬液，调整细胞浓度至1×105/ml，接种于96 孔板并继续培养24h，按分组培养处理后，加入终浓度为50μmol/L 的EdU 孵育2h，加入4%多聚甲醛固定液室温孵育30min，0.5%TritonX-100 室温孵育20min，每孔加入1×Apollo 反应液100μl 避光孵育30min，最后再加入5mg/L Hoechst33342 染色液避光孵育30min，染色完成后立即在荧光显微镜下观察并拍照。EdU 染色细胞发绿色荧光，Hoechst33342 染色细胞发蓝色荧光，EdU 阳性细胞率=暗视野中发绿色荧光细胞数/发蓝色荧光细胞数×100%。

1.2.3 观察细胞自噬流变化 采用荧光显微镜观察法。取对数生长期的HUVECs，制备单细胞悬液，调整细胞浓度至1×105/ml，接种于24 孔板，培养至细胞融合度50%～70%，用mRFP-GFP-LC3 感染24h，再按分组培养处理后，在激光共聚焦荧光显微镜下随机选取多个细胞拍照，包括红色荧光图、绿色荧光图，红光激发的斑点为自噬溶酶体，红光和绿光共同激发的黄色斑点为自噬体。

1.2.4 自噬相关蛋白p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平检测 采用Western blot 法。收集不同处理组的细胞，以RIPA 裂解液充分裂解后再提取细胞总蛋白，冰浴30min 裂解混匀，4℃13 000g 离心10min，BCA 法蛋白定量，SDS-PAGE 分离蛋白质，之后转膜到PVDF 膜上，室温下5%脱脂奶粉封闭1h 后，加入p62、LC3 及GAPDH一抗（1:1000 稀释）4℃孵育过夜，TBST 洗膜3 次，加入HRP 标记的鼠抗兔抗体孵育1h，TBST 洗膜3 次，ECL化学发光法检测蛋白的表达情况。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4 组细胞EdU 染色阳性细胞率比较 4 组细胞用含相关药物的培养基刺激24h 后，EdU 染色阳性细胞率比较差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较，发现与Control 组比较，LPS 组EdU 染色阳性细胞率明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与LPS 组比较，LPS+RAPA 组EdU 染色阳性细胞率明显下降，而LPS+3-MA 组EdU 染色阳性细胞率明显上升，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图1（插页）、表1。

图1 4 组细胞EdU 染色情况（×200）

表1 4 组细胞EdU 染色阳性细胞率比较（%）

2.2 3 组细胞EdU 染色阳性细胞率比较 3 组细胞用含相关药物的培养基刺激24h 后，EdU 染色阳性细胞率比较差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较，与Control 组比较，LPS 组EdU 染色阳性细胞率明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；而与LPS 组相比，LPS+BBR 组Edu 染色阳性细胞率明显上升，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2（插页）、表2。

图2 3 组细胞EdU 染色情况（×200）

表2 3 组EdU 染色阳性细胞率比较（%）

2.3 3 组细胞自噬流变化结果 3 组细胞用含相关药物的培养基刺激24h 后，HUVECs 细胞内自噬体（黄色斑点）和自噬溶酶体（单独红色点）均增加，而应用BBR后，自噬体（黄色斑点）和自噬溶酶体（单独红色点）均减少，见图3（插页）。

图3 自噬双标腺病毒感染后3 组细胞自噬流变化（×630）

2.4 3 组细胞p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平比较 与Control 组比较，LPS 组p62 蛋白表达水平下调，LC-Ⅱ/LC-Ⅰ蛋白表达水平上调，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而与LPS 组比较，BBR 组p62 蛋白表达上升，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达下调，差异均有统计学意义（均P＜0.05），结果见图4、表3。

图4 3 组细胞p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达电泳图

表3 3 组细胞p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平比较

3 讨论

自噬是真核细胞中高度保守的代谢活动，广泛参与多种生理和病理过程[8]。细胞自噬可以被缺血缺氧、饥饿和DNA 受损等多种因素激活，通过形成双层膜囊泡来隔离受损的细胞器或蛋白质，并通过溶酶体结合来降解内容物，分解后为饥饿或代谢压力状态下的细胞提供能量，维持内环境的稳定和平衡[9]。正磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号传导通路是自噬过程中最主要的信号传导通路之一。RAPA 是一种新型大环内酯类免疫抑制剂，也是哺乳动物mTOR 信号通路特异性的负性调控因子，能通过与mTORC1 复合物特异性的结合，促进细胞自噬的发生，因此RAPA 通常作为细胞自噬诱导剂使用[10]。3-MA 则是PI3K 信号通路的特异性抑制剂，可特异性阻断细胞自噬过程中自噬泡与溶酶体的融合，通常作为细胞自噬抑制剂使用[11]。在本研究中，加用RAPA 后，与单纯LPS组相比，诱导自噬后使细胞活力进一步下降，而加用3-MA 后，减轻自噬后细胞活力明显提升，说明细胞自噬在LPS 诱导HUVECs 损伤中发挥重要的作用。

为进一步观察LPS 诱导HUVECs 损伤后自噬的变化及BBR 的干预作用，本研究采用mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬体系来观察自噬流的变化。mRFP-GFP-LC3转染细胞后，LC3 蛋白被RFP 的红色荧光和GFP 的绿色荧光标记。当自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体后，由于溶酶体内部的酸性环境，导致GFP 绿色荧光淬灭，因此单纯红色荧光点（GFP-RFP+）为自噬溶酶体，而红色荧光和绿色荧光融合后的形成的黄色荧光点（GFP+RFP+）即为自噬小体，通过荧光显微镜观察红色荧光点和黄色荧光点数量的变化及相互对比检测即可清晰地看出自噬流的强弱及通畅与否[12]。在本研究中，LPS 作用后HUVECs 内黄色荧光点（主要是自噬小体）和红色荧光点（自噬溶酶体）都增加，而加用BBR 预处理后，黄色荧光点和红色荧光点减少，提示BBR 可能通过抑制自噬对LPS 诱导HUVECs 损伤起保护作用。BBR 是一味传统中药，主要用于胃肠道感染；近年来，多项基础研究表明BBR 具有降血糖、调节血脂、抗氧化应激、抗炎等多种药理作用[13]，本研究结果也进一步证实BBR 在AS 的治疗上具有潜在的应用价值。

LC3 和p62 都是自噬标志性蛋白。自噬过程中，LC3蛋白首先形成胞浆型LC3（LC3-Ⅰ），其后LC3-Ⅰ会酶解掉一小段多肽并和膜磷脂相互作用产生LC3-Ⅱ，靶向结合在细胞内自噬体的膜上[14]，其含量与自噬泡数量呈正相关，因此是自噬过程可靠的标志物，通常用LC3Ⅱ总表达量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的大小两个指标来估计自噬水平的高低[15]。而p62 蛋白作为自噬的选择性底物，在自噬中晚期可进入自噬溶酶体后被降解，其表达与自噬水平呈负相关[16]。在本研究中，LPS 作用HUVECs后，p62 蛋白表达下降，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增大，而加用BBR 干预后，p62 蛋白表达增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值减少，进一步确定BBR 通过抑制过度细胞自噬保护LPS 诱导HUVECs 损伤。但由于细胞自噬的调控过程非常复杂，牵涉到PI3K/mTOR、JNK、AMPK 等多条信号通路，本实验仅是初步证实BBR 可以通过抑制过度自噬对LPS 诱导HUVCs 起保护作用，后续可进一步应用JNK 的特异性抑制剂如SP600125 等进行干预研究，具体自噬的详细过程及可能的机制也有待进一步去研究。

综上所述，本研究初步证实BBR 能通过抑制HUVEcs 的过度自噬对LPS 诱导的HUVECs 损伤起保护作用，为临床上将BBR 作用于内皮细胞损伤相关性疾病和AS 的防治提供理论依据和实验基础。