重组人β 防御素- 2 基因对支气管肺发育不良新生鼠肺泡及肺血管发育的影响

杨娇娇 陈翠娥 孙媛媛 郭金余 狄天伟 张希希

支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是极低和超低出生体重儿最常见的并发症，主要表现为肺泡和肺血管发育受限[1]，近年来发病率逐年升高[2]。BPD 预后差，患儿容易发生肺部感染、肺动脉高压，并影响神经系统及生长发育[3-5]。目前BPD 的治疗措施有限，因此，寻找预防和治疗BPD 的方法至关重要。β防御素-2（β defensin- 2，BD2）是抗菌肽的一员，具有广谱抗菌活性，主要表达于呼吸道、皮肤及泌尿生殖道的黏膜上皮细胞[6]，可诱导、募集炎症因子和免疫细胞，并影响细胞增殖和分化。人β 防御素-2（human β defensin-2，hBD2）在急性肺损伤、肺部感染、肺囊性纤维化、慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）等肺部疾病中发挥重要作用[7-10]，并可通过抑制炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-ɑ 的表达，保护绿脓杆菌引起的肺损伤[11]。本实验通过建立高氧致BPD 动物模型，并将重组hBD2 基因转染至新生鼠肺组织，进一步探讨hBD2 对BPD 肺泡及肺血管发育的影响，为BPD治疗提供新的理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物 SD 成年大鼠购自上海实验动物中心[SCXK（沪）2012-0002]，以雌雄比2∶1 配比合笼交配直到自然生产。本实验对象即为自然生产的新生SD 大鼠，共48 只，体重6～7g。

1.2 主要仪器和试剂 氧舱自动控制系统（温州医科大学机能实验中心），24h HBO-2B 型控氧仪（浙江建德梅城电化分析仪器厂），测氧装置（德国Envite C-Wismar 公司），二氧化碳检测仪（德国Envite C-Wismar 公司），TG radient Thermoblock PCR 扩增仪（德国Biometra 公司），腺病毒载体GV135（上海吉凯基因公司），E.col DH5α 感受态菌株（上海吉凯基因公司），Lipofectamine 2000（美国Invitrogen 公司），293T 细胞（上海吉凯基因公司），戊巴比妥钠（浙江美谷生物科技有限公司），4%多聚甲醛（浙江美谷生物科技有限公司），PBS（浙江美谷生物科技有限公司），Trizol 裂解液（浙江美谷生物科技有限公司），3%过氧化氢溶液（浙江美谷生物科技有限公司），血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）免疫组化试剂盒一抗（美国Abcam 公司），二抗PV9001 兔鼠通用二抗试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），二氨基联苯胺显色液（DAB）（北京中杉金桥生物技术有限公司），TNF-ɑ、IL-1β、IL-6、IL-10 ELISA 检测试剂盒（广州瑞生科技公司）。

1.3 动物模型建立及分组 将48 只大鼠按随机数字表法分为空气组、高氧组、空载体组和hBD2 组4 组，每组12 只。空气组置于21%氧浓度的空气中，其他组均置于氧浓度90%的高氧箱内14d。hBD2 组经气管穿刺气管腔内注入含有1×107/ml hBD2 和编码基因的重组腺病毒25μl；空载体组注入等量对照腺病毒（不含hBD2 编码基因）。室温控制在20～25℃，给予动物12h光照/12h 黑暗交替的环境，每日开箱1h，称重、观察大鼠状态及更换代乳鼠。

1.4 hBD2 重组腺病毒载体构建 hBD2 基因引物按照分子克隆实验指南设计，并在上下游引物的5′分别引入BamHI/AgeI 酶切位点，引物序列为：上游引物：5′-AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGAGGGTC -TTGTATCTC-3′，下游引物：5′-TCCTTGTAGTCCATACCTGGCTTTTTGCAGCATTTTG-3′，以质粒或菌液为模板进行PCR 扩增，获得全长236bp 的hBD2 cDNA。将hBD2 cDNA 片段用连接到具有绿色荧光蛋白（GFP）标记的线性腺病毒载体GV135 上，转化进E.col DH5α 感受态菌株中，筛选阳性克隆，抽提质粒后用BamHI/AgeI双酶切鉴定并测序，得到正确质粒。使用Lipofectamine 2000 将表达hBD2 的腺病毒载体和腺病毒包装质粒混合并共同转染到293T 细胞，荧光显微镜观察GFP 的表达评估转染效率，10～15d 后低速离心收集细胞并重悬，-80℃/37℃反复冻融，振荡3 次，4℃、7 000r/min 离心收集病毒上清液，采用梯度稀释法测定病毒滴度。

1.5 标本采集 分别于大鼠出生后第7、14 天，每组随机取6 只大鼠，1%戊巴比妥钠0.01～0.02ml/g 腹腔注射麻醉，依次切开胸前皮肤，钝性分离皮下组织、肌肉，切断肋骨，打开胸腔，暴露肺组织，结扎右侧支气管，以4%多聚甲醛灌注左肺，浸入4%多聚甲醛固定，置于4℃冰箱保存，用作肺组织形态学分析及免疫组化，将右肺置于-80℃冰箱保存，用作肺组织qPCR 及ELISA 检测。

1.6 肺组织hBD2 mRNA 表达水平检测 采用qPCR法。取-80℃冰箱中冻存的大鼠肺组织约100μg，Trizol裂解液提取肺组织总RNA，逆转录获得cDNA，再置于-20℃冰箱保存备用。采用7 500 RT-PCR 系统SDS 软件，根据2-△△Ct方法计算hBD2 mRNA 表达水平，结果取平均值。

1.7 肺组织形态学观察 4%多聚甲醛固定24h 后，切取左肺中叶，乙醇溶液梯度脱水，石蜡包埋，制作4～5μm 切片，经HE 染色后观察肺组织形态。光镜下摄片，按照文献的方法，测定肺泡辐射状计数（radial alveolar count，RAC）[12]和平均内衬间隔（the mean linear intercept，MLI）[13]。

1.8 肺组织VEGF 表达水平检测 采用免疫组化法。肺组织切片脱蜡，抗原修复，3%过氧化氢溶液处理，血清封闭，一抗4℃过夜（浓度为1:100），PBS 冲洗后加入二抗，37℃孵育50min，DAB 显色，中性树脂封片，镜下观察。用PBS 替代一抗作阴性对照。采用Image-Pro Plus6.0 图像分析软件进行分析，计算每个视野内的染色区域的平均光密度（AOD）值，来反映VEGF 表达水平。

1.9 肺组织IL-6、IL-1β、TNF-ɑ、IL-10 表达水平检测采用ELISA 法。称量组织块100mg，加入预冷的0.9%氯化钠溶液0.9ml，剪碎组织块后倒入匀浆器中制备10%的组织匀浆，低温低速离心15min，取500μl 的上清液备用，按照试剂盒说明书操作测定各炎症因子表达水平。

1.10 统计学处理 采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组hBD2 基因构建评估及病毒滴度测定 hBD2基因转染24h 后即可在荧光显微镜下观察到带有绿色荧光的293T 细胞，见图1（插页），梯度稀释法测定病毒滴度为1×109/ml，用稀释液稀释100 倍得到1×107/ml。

图1 hBD2 基因转染24h 后显微镜下所见（a：普通显微镜，×100；b：荧光显微镜，×100；c：普通显微镜，×200；d：荧光显微镜，×200）

2.2 4 组大鼠肺组织hBD2 mRNA 表达水平比较 在大鼠出生后第7、14 天，与hBD2 组比较，空气组、高氧组、空载体组大鼠hBD2 mRNA 表达水平均明显为低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 4 组大鼠肺组织hBD2 mRNA 表达水平比较

2.3 4 组大鼠肺泡发育情况比较 肺组织形态学显示，随日龄增加，空气组大鼠肺组织发育逐渐成熟，肺泡明显增多；高氧组及空载体组第7 天即可观察到肺泡简单化，即表现为肺泡壁变薄，部分肺泡融合，第14 天时肺发育受阻现象更加明显，肺泡腔扩大，数目减少，结构紊乱，而hBD2 组肺泡发育受阻不明显，见图2（插页）。第7、14天，高氧组和空载体组大鼠的RAC 和MLI 与空气组、hBD2 组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

图2 4 组大鼠肺组织病理检查所见（HE 染色，×100）

表2 4 组大鼠肺组织RAC 及MLI 比较

2.4 4 组大鼠肺组织VEGF 表达水平比较 肺组织VEGF 免疫组化染色后显示VEGF 主要表达于肺泡上皮及肺间隔，随大鼠日龄增长，空气组大鼠肺组织VEGF表达量逐渐增加，高氧组及空载体组大鼠肺组织VEGF表达量无增加，见图3（插页）。第7、14 天，高氧组和空载体组大鼠肺组织中AOD 值均明显低于空气组和hBD2 组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表3。

图3 VEGF 在四组大鼠肺组织中的表达（免疫组化染色，×200）

表3 大鼠肺组织AOD 值比较

2.5 4 组大鼠肺组织TNF-ɑ、IL-1β、IL-6 和IL-10 表达水平比较 第7、14 天，高氧组和空载体组肺组织TNFɑ、IL-1β 和IL-6 的表达明显高于空气组和hBD2 组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；第7、14 天，高氧组、空载体组、hBD2 组肺组织IL-10 表达高于空气组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表4。

3 讨论

早产儿尤其是极早早产儿出生时肺发育尚未成熟，处于小管期和囊管期，肺泡气体交换功能严重受阻，因此，早期的高浓度吸氧或机械通气对于维持早产儿的生存是必需的。但是高浓度吸氧或机械通气在改善了早产儿存活率的同时，亦使得BPD 发病率逐年升高[2]。BPD预后差，容易继发肺部感染、肺动脉高压，同时影响早产儿神经系统发育及生长发育。

表4 4 组大鼠肺组织炎症因子表达水平比较（pg/ml）

防御素为富含半胱氨酸的阳离子蛋白质，包含16～50 个氨基酸，属于抗菌肽家族，广泛存在于人体皮肤和黏膜上皮细胞中，并在抵御病原微生物、介导获得性免疫应答、调节机体免疫反应及抗肿瘤等方面发挥重要作用。hBD2 是第1 个发现的可诱导表达的抗菌肽，其可通过破坏细菌磷脂膜的完整性，改变磷脂酶渗透性从而发挥直接灭菌作用[11]；局部组织发生炎症反应时，hBD2 表达增加，继而募集中性粒细胞来清除病原体，同时刺激树突状细胞和记忆性T 细胞的趋化作用，进一步发挥免疫调节和抗炎作用[14]。研究发现，急性肺损伤大鼠模型肺组织hBD2 的表达增加，其表达量与TNF-ɑ 的表达水平成正相关，提示hBD2 对急性肺损伤具有保护作用[7]。在肺部感染模型中，外源性hBD2 可上调抑炎因子IL-4、IL-10 和IL-13 表达，并下调促炎因子IL-1ɑ、IL-1β、IL-5、IL-6、IL-8、IL-18 和TNF-ɑ 表达，证实了hBD2 可通过调节肺部炎症反应，从而改善肺部感染[2，14-15]。Starner 等[16]研究发现早产儿肺组织hBD2 表达量少，而足月儿肺组织hBD2 表达量明显增加，提示hBD2 可作为肺发育不成熟的指标之一。

炎症是BPD 发生、发展的主要原因之一，当不成熟的肺暴露于高氧环境时，肺部炎症反应增强，炎性细胞浸润，影响肺泡和肺血管发育，最终导致BPD。临床研究表明，患BPD 的风险与血清中高水平和持续表达的多种炎症介质相关[17]。Koksal 等[18]检测了102 例早产儿血清和支气管肺泡灌洗液中炎症因子水平，显示BPD患儿血清和支气管肺泡灌洗液中TNF-ɑ、IL-1β 和IL-6均高于非BPD 患儿，说明上述细胞因子在BPD 发病中可能起到关键作用。Oncel 等[19]发现TNF-ɑ 抑制剂依那西普能改善高氧暴露的鼠肺损伤，促进肺泡成熟，抑制炎症反应，并减轻氧化应激，对BPD 具有保护作用。本实验显示新生大鼠暴露于高氧环境后出现肺泡简单化，表现为RAC 减少及MLI 增大，同时，肺组织促炎因子TNF-ɑ、IL-1β、IL-6 表达水平升高，外源性hBD2 可增加RAC，减小MLI，改善肺泡发育，并可下调TNF-ɑ、IL-1β 及IL-6 表达。既往临床研究表明，患BPD 的早产儿出生后24h 及2 周时血清IL-10 水平明显低于非BPD早产儿[20]，细胞实验亦表明，重组IL-10 治疗可减轻高氧对胎鼠肺泡Ⅱ型细胞的损伤[21]。本实验中，肺组织抑炎因子IL-10 在高氧组和空载体组较空气组升高，hBD2 组表达更高，提示高氧环境下，新生鼠可能通过反应性增加IL-10 表达来抑制炎症反应，但作用轻微，hBD2 可通过促进肺组织IL-10 表达，进而增强其抑炎作用。

VEGF 是血管内皮细胞特异的有丝分裂原，由肺泡上皮细胞产生，影响血管内皮细胞的迁徙、生存、增殖和分化，是整个胚胎期、胎儿期和生后肺血管生长发育最关键的调节因子，在建立正常肺形态和肺功能中发挥重要作用[22]。VEGF 表达水平可直接影响肺血管及肺泡发育，在BPD 的发生发展中发挥着重要作用。Been 等[23]研究报道，BPD 患儿肺泡灌洗液中VEGF 表达水平明显低于非BPD 患儿，且表达水平持续下降。在高氧致BPD 动物模型中，亦发现VEGF 表达量显著低于空气对照组[24-27]，外源性VEGF 可改善高氧所致的的肺泡及肺血管发育受阻[24]。本实验显示新生大鼠暴露于高浓度氧气后，肺组织VEGF 表达减少，提示肺血管发育受阻，而外源性hBD2 干预后，肺组织VEGF 表达升高，提示hBD2 可改善高氧所致的新生鼠肺血管发育受阻。

综上所述，hBD2 可改善BPD 新生鼠肺泡及肺血管发育受阻，与其抗炎机制相关，此研究为BPD 治疗提供了新的理论依据。在后续的实验中，笔者将进行不同剂量hBD2 的对照研究以及进一步的机制研究，以找到最佳的剂量及更全面的作用机制。