3-氨基丙酰胺在丙烯酰胺形成和消减中的作用

吴豪杰 郑 洁 欧仕益 黄才欢

（暨南大学食品科学与工程系 广州510632）

丙烯酰胺具有生殖毒性和神经毒性，在动物实验中致癌[1-2]，被国际机构列入“人类可能致癌物”[3]。食品中的丙烯酰胺主要由羰基化合物与天冬酰胺在高温加热条件下通过美拉德反应产生[4-5]。形成途径之一是通过美拉德反应形成3-氨基丙酰胺，其后在高温下脱氨产生[6]。

前人研究表明，氨基酸氨基和巯基可与丙烯酰胺通过Michael 加成反应形成加合物[7-8]，从而消除丙烯酰胺[9-11]。3-氨基丙酰胺的C-3 的活泼氨基也可与丙烯酰胺发生Michael 加成反应，从而消除丙烯酰胺。本研究首次采用液-质谱联用（HPLCMS-MS）鉴定3-氨基丙酰胺与丙烯酰胺形成的加合物，并研究反应温度、时间和反应物的比例对丙烯酰胺消除的影响，以期阐明3-氨基丙酰胺在丙烯酰胺的形成和消减中的贡献。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3-氨基丙酰胺盐酸盐，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；丙烯酰胺，百灵威科技有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，天津市大茂化学试剂厂；色谱级甲醇，美国Mallinckrodt Baker 公司；纯净水。

1.2 仪器与设备

HR-200 电子分析天平，A & D 公司；SHIMADZMLC-20AT 高效液相色谱分析系统，日本岛津仪器公司；SHIMADZU LC-MS 8045 液-质谱联用分析系统，日本岛津仪器公司；SBH200DC 数字式双温控干浴器，Stuart 公司；带盖20 mL 不锈钢试管，自制。

1.3 方法

1.3.1 加合物的检测 用pH8 的磷酸缓冲溶液配制50 mmol/L 3-氨基丙酰胺溶液，向不锈钢试管中分别加入2 mL 3-氨基丙酰胺和2 mL pH 8 的磷酸缓冲溶液，旋紧管盖，于160 ℃干浴器中反应20 min，冷却至室温。将试管中的样品转移到10 mL 容量瓶中，定容，用高效液相色谱法检测生成物。

1.3.2 加合物的质谱鉴定

1.3.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18柱 （3.0 mm×100 mm，2.7-Micron）；流动相：乙腈-水溶液（20∶80，V/V）；柱温40 ℃，流速0.4 mL/min，进样体积0.5 μL。

1.3.2.2 质谱条件 ESI 离子源，正离子模式Q3扫描，电子能量-20 eV；雾化气流量3.0 L/min，干燥气流量10.0 L/min，加热气流量10.0 L/min；接口温度300 ℃，DL 温度250 ℃，加热块温度400 ℃；准分子离子峰m/z 分别为160 与231，扫描范围m/z 50～1 000。

1.3.3 反应条件对3-氨基丙酰胺消减丙烯酰胺的影响

1.3.3.1 反应温度对3-氨基丙酰胺消减丙烯酰胺的影响 向不锈钢试管中分别加入2 mL 50 mmol/L 3-氨基丙酰胺与2 mL 50 mmol/L 丙烯酰胺溶液，旋紧管盖，然后将试管分别置于120，140，160，180 ℃和200 ℃的干浴器中反应20 min，考察不同反应温度下3-氨基丙酰胺对丙烯酰胺的消减率。

1.3.3.2 反应时间对3-氨基丙酰胺消减丙烯酰胺的影响 向不锈钢试管中分别加入2 mL 50 mmol/L 3-氨基丙酰胺与2 mL 50 mmol/L 丙烯酰胺溶液，旋紧管盖，将试管置于160 ℃的干浴器中分别加热10，15，20，25 min 和30 min，考察不同反应时间下3-氨基丙酰胺对丙烯酰胺的消减率。

1.3.3.3 反应物的浓度比对3-氨基丙酰胺消减丙烯酰胺的影响 将适量的丙烯酰胺和3-氨基丙酰胺添加到不锈钢试管中，使其浓度比分别为1 ∶5，2∶5，3∶5，4∶5 和1∶1，3-氨基丙酰胺终浓度为25 mmol/L。旋紧管盖，然后将试管置于160 ℃的干浴器中分别加热20 min，考察丙烯酰胺与3-氨基丙酰胺的浓度比对丙烯酰胺消减率的影响。

1.4 丙烯酰胺的检测

色谱条件：色谱柱：Atlantis T3，4.6mm×150 mm，5 μm；流动相：甲醇（A）和超纯水（B），梯度洗脱条件为：0～4 min：10% A；4.01～5 min：10%～80%A；5.01～8 min：80% A，；8.01～9 min：80%～10% A；9.01～15 min：10% A；流速0.7 mL/min，进样量5 μL，柱温40 ℃，检测波长205 nm。

1.5 丙烯酰胺消减率的计算公式

式中：A1——丙烯酰胺单独加热后体系中丙烯酰胺的量；A2——3-氨基丙酰胺单独加热后体系中丙烯酰胺的量；A3——3-氨基丙酰胺与丙烯酰胺混合加热后体系中丙烯酰胺的量。

1.6 数据处理

对每种处理做3 次平行试验，用SPSS 17.0处理试验数据。

2 结果与分析

2.1 加合物

采用高效液相色谱法检测3-氨基丙酰胺在160 ℃反应20 min 后的样品，结果发现样品的谱图中不仅有3-氨基丙酰胺和丙烯酰胺的吸收峰，还出现两个新的吸收峰（图1）。同时，3-氨基丙酰胺与丙烯酰胺也出现同样的两个新吸收峰，推测3-氨基丙酰胺与丙烯酰胺之间发生相互作用。

图1 3-氨基丙酰胺样品160 ℃反应20 min 后的液相色谱图Fig.1 HPLC chromatography of the reaction products after heating 3-aminopropanamide at 160 ℃for 20 min

图2 3-氨基丙酰胺和丙烯酰胺可能形成的加合物Fig.2 Possible adduct formed between 3-aminopropanamide and acrylamide

2.2 加合物的质谱鉴定

2.2.1 质谱分析 在电喷雾正离子模式下，检测新的吸收峰中物质的分子质量。由图3可见，新的吸收峰中有2 个物质，它们均以[M+H]+准分子离子峰形式存在（m/z 分别为160 和231），同时出现的还有它们的加钠峰[M+Na]+（m/z 182 和253）。由于3-氨基丙酰胺C-3 的活泼氨基可与丙烯酰胺发生迈克尔加成反应，新吸收峰中的物质很可能是按图2的反应途径生成2 种加合物。

进一步分析新组分的结构及其质谱裂解途径，对2 个新组分的ESI-MS2碰撞诱导裂解进行研究。化合1 的准分子离子[M+H]+为m/z 160，由图4a 可知，在二级质谱图中出现两个相对丰度较高的碎片离子m/z 101 和m/z 84。其中m/z 101是加合物与N-4 位相连的C-C 键裂解后生成（N-裂解[12-13]），继而在其羰基侧发生裂解给出m/z 84；另外，非专一性N 原子上的氢转移而产生了m/z 72（C3H6NO·）。化合2 的准分子离子[M+H]+为m/z 231（图4b），在二级质谱图中相对丰度最高的碎片离子m/z 172，是加合物发生N-裂解失去烷基酰胺产生；其中m/z 101 是加合物与N-4 位相连的C-C 键裂解后生成 （N-裂 解），而m/z72（C3H6NO·）同样为非专一性N 原子上的氢转移后生成，由此推测加合物的分子结构及分子碎片见图5。

图3 3-氨基丙酰胺与丙烯酰胺加合物的质谱图（正离子模式）Fig.3 Spectrum of the reaction products between 3-APA and acrylamide （in positive ionisation mode）

图4 加合物的二级质谱（a：相对分子质量159，b：相对分子质量230）Fig.4 MS-MS spectrum of the reaction product 1 （MW=159，a） and reaction product 2 （MW=230，b）

图5 正离子模式下3-氨基丙酰胺-丙烯酰胺加合物的结构式及碎片信息Fig.5 Predicted chemical formulas and molecular fragments information of 3-APA-acrylamide adducts in positive mode

2.2.2 加合物的高分辨质谱分析 采用高分辨质谱测定加合物的相对分子质量，并拟合出相对分子质量为159 和230 的产物的分子式分别为C6H13N3O2与C9H18N4O3。由2.2.1 节可知，加合物2为3，3'，3'-次氮基三丙酰胺，在正离子模式下，比较标准品与加合物2 的二级质谱（图6），其相对分子质量与碎片信息高度吻合。

图6 正离子模式下标准品（a）与加合物2（b）的高分辨二级质谱图Fig.6 HRMS-MS of the standard （a） and reaction product 2 （b） in positive mode

2.3 反应条件对3-氨基丙酰胺消减丙烯酰胺的影响

2.3.1 反应温度对3-氨基丙酰胺消减丙烯酰胺的影响 随着温度的不断上升，3-氨基丙酰胺产生的丙烯酰胺逐渐增多，并在200 ℃时达到最大值，丙烯酰胺浓度随着温度的上升而略有下降，不明显；而丙烯酰胺消减率随着温度的不断升高呈先上升后下降的趋势，在160 ℃时消减率达到最大值43.37%（表1）。其原因可能是由于120 ℃时，3-氨基丙酰胺与丙烯酰胺的加合反应较为缓慢，导致丙烯酰胺消减率不高。随着温度的不断上升，反应程度不断增加，160 ℃时消减率达到最大值；随后随着温度的进一步上升，丙烯酰胺消减率不断下降，说明高温促进了3-氨基丙酰胺转化为丙烯酰胺。

2.3.2 反应时间对3-氨基丙酰胺消减丙烯酰胺的影响 3-氨基丙酰胺单独加热时，随着反应时间的延长，丙烯酰胺产生量逐渐增多，反应时间为30 min 时，丙烯酰胺的产生量比加热10 min 时增加13 倍。丙烯酰胺单独加热体系中，其含量随着加热时间的延长略有下降。在3-氨基丙酰胺与丙烯酰胺同时加热的体系中，丙烯酰胺的消减率随着加热时间的增加呈先上升后下降的趋势，当加热时间在20 min 时，丙烯酰胺的消减率达到最大值43.37%（表2）。其原因可能是160 ℃下，随着加热时间的延长反应程度不断加大，在20 min 时丙烯酰胺消减率达到最大值；之后随着加热时间的延长，可加合物在此条件下不稳定，逐渐分解，重新释放出3-氨基丙酰胺与丙烯酰胺，导致丙烯酰胺消减率不断下降。

表1 不同温度对丙烯酰胺消减的影响Table 1 Effect of different temperature on acrylamide elimination

表2 加热时间对丙烯酰胺消减的影响Table 2 Effect of heating time on acrylamide elimination

2.3.3 反应物的浓度比对3-氨基丙酰胺消减丙烯酰胺的影响 3-氨基丙酰胺消减丙烯酰胺的量随着丙烯酰胺添加量的不断增大呈先上升后下降的趋势，当丙烯酰胺与3-氨基丙酰胺浓度比为3∶5 时，丙烯酰胺消减率达到最大值47.29%。通过对比液相色谱图发现丙烯酰胺与3-氨基丙酰胺浓度较低时形成的加合物有两种，而当丙烯酰胺与3-氨基丙酰胺浓度比增大到3∶5 时所形成的加合物仅1 种。其原因可能为加合反应的类型有两种，当丙烯酰胺的量较少时，1 分子的丙烯酰胺与1分子的3-氨基丙酰胺通过迈克尔加成反应形成相对分子质量为159 的加合物1 后，部分加合物1 再与一分子的丙烯酰胺继续反应形成加合物2（相对分子质量为230）。而当丙烯酰胺的量不断增大时，反应向着生成相对分子质量为230 的加合物的方向进行，消耗了体系中的加合物1；当丙烯酰胺过量时，由于3-氨基丙酰胺不足，过量的丙烯酰胺无法通过形成加合物被消减，导致丙烯酰胺的消减率下降。

3 结论

采用高效液相色谱-质谱联用技术对3-氨基丙酰胺与丙烯酰胺通过迈克尔加成反应形成的产物进行研究，结果表明：3-氨基丙酰胺不仅能在高温下脱氨形成丙烯酰胺，也可与生成的丙烯酰胺通过迈克尔加成反应形成两种加合物，其相对分子质量分别为159 与230。考察不同反应条件对3-氨基丙酰胺消减丙烯酰胺的影响，发现丙烯酰胺消减率随温度、时间、丙烯酰胺与3-氨基丙酰胺的浓度比的增加呈先上升后下降的趋势；当丙烯酰胺与3-氨基丙酰胺浓度之比较低时，体系中同时存在加合物1 和加合物2；而当丙烯酰胺与3-氨基丙酰胺浓度增加到3 ∶5 时，体系中有47.29%的丙烯酰胺被消除，且反应产物只有由2分子的丙烯酰胺与1 分子的3-氨基丙酰胺形成的加合物2。

表3 丙烯酰胺添加量对丙烯酰胺消减的影响Table 3 Addition amounts of acrylamide on the effect of acrylamide elimination

本研究发现两种丙烯酰胺与3-氨基丙酰胺的加合物，为美拉德反应中产物的相互作用机制提供了理论基础。