云南建水豆腐酸浆中乳酸菌的分离与鉴定

刘琳琳 王嘉琪 曾剑华 杨春华 吕铭守 王 冰 张 娜 石彦国

（哈尔滨商业大学食品工程学院 黑龙江省谷物食品与谷物资源综合加工重点实验室 哈尔滨150076）

酸浆是豆腐制作过程中压制后得到的黄浆水经微生物发酵，pH 值逐渐降低，成为酸浆[1-2]。酸浆作为豆腐凝固剂已逾百年，酸浆豆腐在中国民间有上百年的历史，其味道独特，口感醇香细腻，弹性较好，属天然绿色食品，深得消费者的喜爱[3]。云南建水酸浆豆腐尤以历史悠久、风味独特，久负盛名，遴选成为《舌尖上的中国》的经典食材。然而，目前建水酸浆豆腐的制作大多数以家庭作坊或小工厂为主，且一直沿用传统的手工生产方式[4]，其品质仅凭借经验丰富的“豆腐匠”来保持稳定，且传统酸浆豆腐生产模式的卫生条件难以保证。如何工业化生产出品质稳定的酸浆豆腐，稳定酸浆的品质成了当前的难题。

目前，云南建水酸浆的制作主要是以纯正的老酸汤为引子，将豆腐压制产生的黄浆水倒入其中，静置1d，经自然发酵而成，发酵形成的酸浆pH值在4 左右。此外，经发酵，还赋予酸浆独特的有机酸和菌群，研究表明，自然发酵酸浆中有机酸主要为L-乳酸[5]，表明乳酸菌是酸浆中的主要微生物。如，孟克毕力克等[6]从内蒙的自然发酵豆腐酸浆中分离得到4 株乳酸杆菌以及1 株明串珠球菌，并确定酸浆中主要产酸菌为乳杆菌属的乳酸菌；胡欣欣[7]从湖南自然酸化的豆腐酸浆中分离鉴定出1 株嗜酸乳杆菌；尹向垄等[8]从许昌豆腐酸浆中分离得到1 株解淀粉乳杆菌，并应用其制备酸浆凝固剂；乔支红等[9]从多个地区的6 份酸浆老汤中分离纯化出12 种乳酸菌，筛选出1 株产酸较快、较高的屎肠球菌乳酸菌；Li 等[10]从湖南自然发酵酸浆中分离出140 株乳酸菌，并确定了7 株乳酸菌发酵的酸浆能用于生产酸浆豆腐。由此可知酸浆中的优势乳酸菌是制作酸浆豆腐的关键所在，直接关系到酸浆豆腐的质构、风味和营养价值。乳酸菌是益生菌的主要来源之一，因其具有多种保健功效[11-14]，近年来研究者也在致力于找到更多好的乳酸菌资源应用到食品中。经适合的乳酸菌发酵而成的豆制品也越来越收到关注[15-16]。若实现了云南建水酸浆中的主要乳酸菌的分离选育，对酸浆进行纯种发酵，不仅为制备标准化酸浆和酸浆豆腐制作技术规范提供理论依据，对酸浆豆腐的规模化生产和推广具有重要意义，还为开发新型益生菌发酵豆制品提供了新的资源来源。

本研究运用传统纯培养法和16SrRNA 基因序列分析法对云南建水豆腐酸浆中乳酸菌进行分离鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酸浆，云南建水酸浆豆腐生产用酸浆；MRS 肉汤培养基，北京陆桥技术股份有限公司；细菌微量生化鉴定管，北京陆桥技术股份有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒（离心柱型）、DNA 凝胶回收试剂盒、Pfu DNA 聚合酶、DNA Marker，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.2 仪器与设备

BM2000 型光学显微镜，南京江南永新光学有限公司；P302 型笔试pH 计，上海佑科仪器仪表有限公司；JY5000 电泳仪，北京市君意机电技术公司；T100-PCR 扩增仪，杭州博日科技有限公司；S-3400 扫描电镜，天美日立公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品采集 酸浆采集自云南建水县，将采集的样品分装于灭菌的容器内，采用冰盒低温保藏，在36 h 内进行菌种分离，并将样品于冰箱内贮存备用。

1.3.2 建水酸浆中乳酸菌的分离纯化 取酸浆梯度稀释后，分别取不同浓度的稀释液0.2 mL，涂布于含有体积分数2% CaCO3的MRS 培养基上，在37 ℃条件下厌氧培养48 h。挑取有溶钙圈的菌落划线于固态MRS 培养基上，继续培养48 h。挑取单个菌落重复分离直至培养得到纯种菌株。将菌株进行编号，分别进行4℃斜面短期保藏。

1.3.3 建水酸浆中乳酸菌的鉴定

1.3.3.1 建水酸浆中乳酸菌的形态学特征鉴定[17]将菌落革兰氏染色，然后在4×100 倍油镜下观察菌落的形态特征（颜色、大小、边缘情况等）。初步鉴定以菌落形态中间隆起、静止、无孢子且呈革兰氏染色阳性等特征的定为乳酸菌，然后分离纯化得到纯种菌株。

1.3.3.2 建水酸浆中乳酸菌的生理生化特征鉴定 对分离得到纯菌株做运动性试验、过氧化氢酶试验、葡萄糖产气试验、精氨酸产氨试验、H2S 生成试验、明胶液化试验、吲哚试验和糖发酵试验及菌属鉴定，均参照《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》[18]和《伯杰细菌鉴定手册》[19]。

1.3.3.3 建水酸浆中乳酸菌的分子生物学鉴定[20-21]

①菌株DNA 的提取 按照天根细菌基因组DNA 提取试剂盒（离心柱型）进行，并进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

②16SrDNA 基因序列的PCR 扩增 在DNA完整的条件下，采用细菌通用引物（27F 为正向引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1 492R为 反 向 引 物：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行PCR 扩增。PCR 扩增体系50 μL，含5.0 μL 10×PCR Buffer、1 μL 正向27F 引物、1 μL 反向1 492R 引物，1 μL 模版基因组DNA，0.5 μL 5 U/μL Pfu DNA 聚合酶，加水至50 μL。

PCR 扩增反应程序：首先在95 ℃预变性3 min，94 ℃变 性20 s，55 ℃退 火20 s，72 ℃延 伸50s，72 ℃修复延伸5 min，共进行35 个循环。

③16SrDNA 的基因片段测序 PCR 扩增后的产物经1%琼脂糖电泳检测后测序。

④登陆NCBI（www.ncbi.nlm.gov/blast/）网站，输入16S rDNA 的测序结果，在Gen Bank 中进行BLAST 分析比对，确定其属种，采用MEGA 6.0 软件构建系统发育树。

1.3.4 数据分析 每组试验平行3 次，采用Excel 2013 和SPSS22.0 进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

由于乳酸菌的产酸作用会使加有碳酸钙的MRS 培养基上的菌落周围产生溶钙圈，所以在选择性培养基上挑选出有溶钙圈的菌落，将其在MRS 平板上经过多次反复分离，结合革兰氏染色，通过显微镜观察，最终得到5 株革兰氏阳性菌，对其编号并观察、记录各株菌的菌落形态，如图1所示。在显微镜下观察，菌体形态如图2所示。在扫描电镜下观察，电镜图像如图3所示。上述各菌株菌落及细胞主要形态特征如表1所示。通过形态学鉴定5 株菌均符合乳酸菌的形态学特征，可初步判断5 株菌株为乳酸菌。

2.2 生理生化鉴定

对分离的5 株菌株进行鉴定，结果如表2。根据表2数据，参照《伯杰细菌鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》 初步判断SYG01、SYG02、SYG03 和SYG05 属 于 乳 杆 菌 属（Lactobacillus），SYG04 属于魏斯氏菌属（Weissella）。

2.3 分子生物学鉴定

图1 5 株菌株的菌落形态Fig.1 Colony morphology of five strains

图2 5 株菌株的革兰氏染色图Fig.2 Gram staining of five strains

图3 5 株菌株在扫描电镜（10k×）下的图像Fig.3 SEM（10k×）photographs of cell morphology of five strains

2.3.1 菌株的DNA 提取及16S rDNA 序列扩增5 株菌株分别接种于MRS 培养基中培养，采用细菌DNA 提取试剂盒提取菌体DNA，产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，如图4所示。分别以5 株菌的总DNA 为模板，27f 和1 492r 为引物进行PCR扩增。扩增后的产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，5 株菌在约1 500 bp 处均有特异性条带，如图4所示。

表1 5 株菌株的形态学特征Table 1 Morphological character of five stains

表2 5 株菌株的生理生化鉴定结果分析Table 2 Analysis of physiological and biochemical characterization for five stains

图4 5 株菌株的琼脂糖凝胶电泳图Fig.4 Agarose gel electrophoresis of the five strains

图5 5 株菌株的16S rDNA PCR 扩增电泳图Fig.5 Electrophoresis of the PCR amplification of 16S rDNA gene of the five strains

2.3.2 菌株的同源性分析及构建系统发育树 分析结果表明，SYG01 的16S rRNA 序列共1 444 bp，SYG02 的16S rRNA 序列共1 456 bp，SYG03的16S rRNA 序 列 共1 445 bp，SYG04 的16S rRNA 序列共1 457 bp，SYG05 的16S rRNA 序列共1 456 bp。将序列结果用BLAST 进行序列同源性比对，见表3。结果表明：5 株菌的同源性均达到99%，可以判定其属于同一个种[22-23]。结合形态学特征、生理生化特征及16S rRNA 分子生物学鉴定，菌株SYG01、SYG02、SYG03、SYG04、SYG05 分别为短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）、弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）、融合魏斯氏菌（Weissella confusa）、Lactobacillus concavus。根据同源性比对结果，构建系统发育树，结果见图6。

表3 5 株菌株的同源性分析Table 3 Homology analysis of five strains

图6 5 株菌株的系统进化树Fig.6 Phylogenetic tree of five strains

3 结论与讨论

为实现云南建水酸浆中的主要乳酸菌分离选育，纯种发酵酸浆，本研究从自然发酵的云南建水县酸浆豆腐所用的酸浆中分离得到5 株乳酸菌，采用形态学、生理生化特性和16SrDNA 序列分析对其进行鉴定，并构建系统进化树。结果表明，SYG 01 为短乳杆菌，SYG 02 为棒状乳杆菌，SYG 03 为弯曲乳杆菌，SYG 04 为融合魏斯氏菌，SYG 05 为Lactobacillus concavus。

传统食品如豆制品、肉制品、泡菜、乳制品等食品的自然发酵生产有悠久的历史，在发酵工业中有巨大的应用潜力，从传统发酵食品中分离优势菌已经成为当今的研究热点[24]。云南地区传统发酵豆制品由于其独特的人文地理环境，创造出具有浓厚区域特色和风味的豆制品，其中以酸浆豆腐最为出名。人们在制作这些传统豆制品时往往会引入生物发酵技术，给这些豆制品带来了特有的酵香风味和特质的口感。乳酸菌在这些自然发酵过程中起着重要作用。经过长时间的自然驯化，一些具有优良特性的乳酸菌被很好地保留下来。研究表明，从食品自身中分离出的乳酸菌更有竞争力，是该食品进行乳酸菌发酵的最优菌株[25]。本研究在自然发酵酸浆中分离得到短乳杆菌、融合魏斯氏菌和Lactobacillus concavus，目前国内还未见报道。传统自然发酵酸浆中的乳酸菌呈多样化性。分离得到的短乳杆菌、棒状乳杆菌、弯曲乳杆菌广泛存在于传统的蔬菜、植物材料的发酵食品中，如酸菜[26-27]、豆酱[28-29]、泡菜[30-31]等，其中弯曲乳杆菌还存在于一些发酵肉制品中[32]，而融合魏斯氏菌在食品中也有应用，如酸菜、水产品、乳产品[33-35]等。Lactobacillus concavus 从中国白酒窖墙壁中分离得到[36]。本研究通过分离鉴定酸浆中乳酸菌，为今后研究不同的乳酸菌对酸浆发酵风味的影响，筛选合适的乳酸菌进行纯种发酵或混合菌发酵酸浆提供理论支撑，并对酸浆豆腐的工业化生产有重要的意义。