血清胆汁酸谱系测定在肝硬化诊断中的应用价值

易佳音，张淑凤，冯慧芬，孙会卿，王 斌，赵 敬

郑州大学第五附属医院消化内科 郑州 450052

我国肝硬化发病率高，影响面广，而明确肝损伤程度、分辨肝硬化早期改变和判断肝硬化分级一直是备受临床医生关注的课题，临床多用Child-Pugh分级来判断肝损伤的严重程度和明确分级[1-2]，但此评分系统会受到主观因素的影响。血清胆汁酸是反映肝脏合成、分泌及转运功能的一项指标，在肝硬化发展过程中呈现动态的改变，是作为判断肝损伤程度和明确肝硬化状态及分级的一项良好的指标[3-5]。本研究对肝硬化组及正常对照组血清胆汁酸谱系进行了检测，以明确血清胆汁酸谱系评估肝损伤程度、提示早期肝硬化及确定肝硬化分级的价值，并期望找到肝硬化治疗的突破点。

1 对象与方法

1.1研究对象筛选2018年4～9月郑州大学第五附属医院收治的肝硬化(排除胆汁淤积型肝硬化)患者34例，其中男19例，女15例，年龄45～82(58.0±9.3)岁，肝硬化的诊断基于临床表现、实验室检查、CT或MRI典型成像表现的组合；正常对照组来自同期在本院进行健康体检的志愿者50例，年龄33～80(56.8±11.7)岁，其中男27例，女23例，两组一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。该实验方案获本院伦理委员会批准，所有入选对象对该研究知情同意。

1.2检测项目及方法正常对照组于本院空腹查总胆汁酸、胆红素、白蛋白、凝血酶原时间等检查并记录结果。肝硬化组入院第2天空腹行基础生化检查，进行Child-Pugh分级(Child A级5～6分，Child B 级7～9分，Child C级10～15分)并记录；同时采集两组研究对象的静脉血；离心、收集血清1 mL，使用液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)检测血清中5种未结合胆汁酸[胆酸(CA)、脱氧胆酸(DCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、熊脱氧胆酸(UDCA)、石胆酸(LCA)]、10种结合胆汁酸[甘氨胆酸(GCA)、甘氨石胆酸(GLCA)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺石胆酸(TLCA)、牛磺脱氧胆酸(TDCA)、牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)]。

1.3统计学处理采用SPSS 22.0进行数据分析，经检测两组胆汁酸谱系各组分数据为非正态分布，采用中位数和上、下四分位数表示[中位数(P25，P75)]，正常对照组和肝硬化组、正常对照组和Child-Pugh A级组间比较采用Mann-WhitneyU检验；Child-Pugh A、B、C级三组组间比较采用Kruskal-WallisH检验；对胆汁酸谱系进行诊断特征曲线(ROC)分析，选取具有较高诊断价值的指标，计算其灵敏度及特异度。计算总胆汁酸、胆红素、白蛋白、凝血酶原阳性率，与有较高诊断价值指标的阳性率做比较。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1肝硬化患者胆汁酸谱系测定结果见表1。由表1可知，与正常对照组相比，肝硬化组血清未结合胆汁酸含量减少，结合胆汁酸含量明显增多。

表1正常对照组和肝硬化组胆汁酸谱系含量比较[M(P25，P75)] nmol/L

胆汁酸谱系正常对照组(n=50)肝硬化组(n=34)ZPCA95.39(55.70,193.17)87.31(56.99,563.64)0.5830.560 DCA333.35(102.68,574.32)117.73(50.69,312.42)2.5480.011CDCA719.85(346.20,1 447.04)254.53(116.09,743.08)3.518<0.001UDCA139.89(71.13,265.03)66.55(22.77,348.69)2.2870.022LCA36.67(17.89,49.57)17.72(6.65,26.67)3.746<0.001GCA157.66(65.92,297.69)4 174.69(628.42,9 255.66)6.379<0.001GLCA3.99(1.89,11.27)7.08(2.80,22.97)2.0820.037GDCA168.19(57.76,327.66)237.70(150.50,1 417.63)3.662<0.001GCDCA960.41(448.67,1 601.49)10 034.31(2 008.84,19 065.28)5.522<0.001GUDCA122.60(66.27,346.48)290.20(86.13,1 466.39)2.3150.021 TCA10.70(5.63,29.76)3003.21(134.29,5 583.43)7.062<0.001TLCA0.48(0.09,1.64)3.55(1.36,14.35)4.784<0.001TDCA26.30(7.83,55.44)68.51(8.24,320.41)2.1050.035TCDCA69.61(36.62,137.35)5 847.05(283.17,15 128.50)6.452<0.001TUDCA4.24(1.71,9.60)72.76(9.27,206.36)5.404<0.001

2.2正常对照组与Child-Pugh A级胆汁酸谱系比较见表2。由表2可知，两组检测值中CA、DCA、UDCA、GLCA、TDCA差异无统计学意义(P>0.05)，CDCA、LCA、GCA、GDCA、GCDCA、GUDCA、TCA、TLCA、TCDCA、TUDCA差异有统计学意义(P<0.05)，其中GCA、GDCA、GCDCA、GUDCA、TCA、TLCA、TCDCA、TUDCA 8种结合胆汁酸在Child-Pugh A级的含量比正常对照组的含量增高。

表2正常对照组与Child-Pugh分级A胆汁酸谱系比较[M(P25，P75)] nmol/L

胆汁酸谱系正常对照组(n=50)Child-Pugh分级A(n=13) ZPCA 95.39(55.70,193.17)85.88(66.91,585.08)0.9320.351DCA333.35(102.68,574.32)212.00(65.44,312.42)2.3280.200CDCA719.85(346.20,1 447.04)334.01(148.90,749.55)2.8350.005UDCA139.89(71.13,265.03)136.00(42.25,454.00)1.1690.243LCA36.67(17.89,49.57)17.80(4.73,27.00)3.465<0.001GCA157.66(65.92,297.69)787.86(333.52,1573.98)5.846<0.001GLCA3.99(1.89,11.27)6.28(2.54,24.07)0.9140.361GDCA168.19(57.76,327.66)218.80(137.00,390.77)2.1220.034GCDCA960.41(448.67,1 601.49)3 530.40(989.25,6 202.60)5.014<0.001GUDCA122.60(66.27,346.48)145.36(70.22,424.23)2.4690.014TCA10.70(5.63,29.76)270.39(70.04,837,18)6.148<0.001TLCA0.48(0.09,1.64)3.00(1.22,8.34)3.974<0.001TDCA26.30(7.83,55.44)65.07(7.00,151.30)1.5860.113TCDCA69.61(36.62,137.35)623.86(162.08,1 328.15)5.846<0.001TUDCA4.24(1.71,9.60)24.54(6.03,48.69)5.103<0.001

2.3不同Child-Pugh分级间胆汁酸谱系的变化见表3。由表3可知，不同Child-Pugh分级间CA、DCA、CDCA、LCA、UDCA、GLCA、TDCA差异无统计学意义(P>0.05)，GCA、GDCA、GCDCA、GUDCA、TCA、TLCA、TCDCA、TUDCA差异有统计学意义(P<0.05)，并呈现逐级递增的趋势。

表3 不同Child-Pugh分级胆汁酸谱系的变化[M(P25，P75)]nmol/L

2.4各型胆汁酸谱系诊断评价结果见表4。由表4可知，有较高诊断价值(AUC>0.90)的指标分别为TCA(AUC=0.956),TCDCA (AUC=0.916), GCA(AUC=0.912)，其敏感度及特异度均较高。

表4 胆汁酸相关诊断性能指标

2.5各指标诊断阳性率比较根据ROC曲线,求取各指标的临界值，计算相关胆汁酸阳性率，并计算总胆汁酸、白蛋白、胆红素、凝血酶原的阳性率进行比较分析，见表5。结果表明TCA、TCDCA、GCA三项的阳性率均高于总胆汁酸、白蛋白、胆红素及凝血酶原。

表5 各项指标阳性率对照表

3 讨论

胆汁酸是一种存在于胆汁中、在肝微粒体内由胆固醇合成来的物质，当肝脏发生病变，胆汁酸的合成、分泌和转运都会受到影响，而胆汁酸谱系的变化比血清总胆汁酸更清楚地反映肝脏这三项功能[3]。胆汁酸谱系在肝硬化早期就有明显的改变，其发生改变的时间比其他生化指标都早[6-7]，有学者[8]还认为在肝硬化早期，肝脏生化指标均正常时，胆汁酸谱系也会异常，这是一项能反映肝脏轻微异常的指标。且在肝损伤、肝硬化早期、肝硬化代偿期及失代偿期，胆汁酸谱系比例改变均不相同[9-10]。在对胆汁酸谱系研究中Liu等[11]认为TCA是肝硬化进展的主要生物标志，其细胞实验发现TCA会增加肝星形细胞的增殖，上调肿瘤坏死因子(TGF)和Ⅰ型胶原的表达。Verbeke等[12]提出体内与肝硬化相关的核受体有法尼醇受体(FXR)以及孕烷X受体(PXR)，胆汁酸作为这些核受体的信号分子调控着肝硬化的发生。其中与FXR、PXR有最大亲和力的配体分别为CDCA、LCA[13-14]。两者间的这种调控作用，也为肝硬化的治疗提供了新思路。相关动物实验[15]表明，小鼠体内胆汁酸转运蛋白(BSEP)、磷脂酰碱转运蛋白(MDR3)和多耐药相关蛋白(MRP2)可以通过调节胆汁酸谱系水平来维持核受体的激活状态，以阻止肝硬化的进展。相关研究[16-20]表明，乙型肝炎病毒(HBV)和丁型肝炎病毒(HDV)的真正受体是肝脏特异性胆汁酸转运蛋白-牛磺胆酸钠协同转运多肽(NTCP)，该受体通过FXR介导以依赖胆汁酸的方式调控着HBV的转录，而且NTCP介导的抗HBV物质与其他途径相比，耐受性更好。

在本研究中作者使用LC-MS法，高效、高灵敏的检测了两组血清胆汁酸谱系，与正常组相比，肝硬化组血清未结合胆汁酸相对含量减少，结合胆汁酸相对含量明显增多，两组血清胆汁酸谱检测值与相关[11]报道基本相同，也印证了该方法和结果的有效性；与正常组相比，Child-Pugh A级患者血清胆汁酸谱系已发生改变，并且随着肝脏分级的增加肝硬化组胆汁酸谱系中GCA、GDCA、GCDCA、GUDCA、TCA、TLCA、TCDCA、TUDCA呈现递增的趋势，而未结合胆汁酸则出现不同程度的降低，这提示胆汁酸谱系可以反映肝损伤程度、提示早期肝硬化，并可作为Child-Pugh分级的有效补充，减少因腹水和肝性脑病的判断偏差带来的人为误差，以提高肝硬化分级的准确度；同时，肝硬化诊断曲线及阳性率也提示TCA对肝硬化的诊断有高敏感性；而肝硬化组中相对含量减少的未结合胆汁酸就包括CDCA和LCA，这也支持了Verbeke的核受体理论，可为肝硬化治疗指明新方向。

综上所述，肝硬化胆汁酸谱系的检测不但能早期反映肝损伤及提示早期肝硬化，并可作为Child-Pugh分级的有效补充，准确了解肝硬化病情进展情况，但核受体和转运蛋白的应用还需更深入的研究，以找到更有效可行的治疗方法，最终应用于临床。