甘胆酸试剂盒性能评估

任爱武 杜娟

北京协和医院检验科

血清甘胆酸是胆酸和甘氨酸结合成的结合型胆酸之一，在肝细胞里面，胆固醇经过特别复杂的酶促反应，转变为初级胆汁酸。其中有胆酸和鹅去氧胆酸。胆酸的类固醇核上面有三个羟基(C3、C7、C12），侧链末端的羟基以肽键和甘氨酸结合而成。血清甘胆酸正常的代谢途径是肠―肝循环，血清甘胆酸由肝细胞合成，通过毛细胆管、胆管排进胆囊，随着胆汁进入十二指肠，帮助食物进行消化。95%的胆酸在回肠末端被重吸收，经过门静脉再回到肝脏，被肝细胞摄取后再利用。在血清中以蛋白结合形式为主而存在，溢入体循环的总量小于1 %。在正常情况下,外周血中胆酸含量甚微极其少,正常成人不管是空腹还是餐后,其血清甘胆酸浓度都稳定在低水平。当肝细胞受到损伤时，肝细胞摄取甘胆酸的能力下降，导致血中的甘胆酸含量增高；胆汁郁滞时，肝脏排泄胆酸就会发生障碍，从而返流血液循环的甘胆酸含量就会增高，使血中甘胆酸含量也增高。所以，测定血清甘胆酸是评价肝细胞功能和肝胆系物质循环功能的敏感指标之一[2]。

本试验评估的甘胆酸试剂盒，采用均相酶免疫法测定样本中甘胆酸(CG)的含量。本试验从携带污染率、精密度、线性、最低检测限、参考范围验证等方面测试甘胆酸试剂盒的性能指标，评估其临床应用能力。

一、材料与方法

（一）对象

1.携带污染率：将已知甘胆酸高浓度值血清（约40μg/ml）、分装5份于-20°C冻存，和去离子水5份，用于携带污染试验[3]。

2.精密度验证混合血清：将已经知道甘胆酸浓度的患者的血清进行混合，制备高浓度和低浓度（约40μg/ml和2.5μg/ml）的两份混合血清，各分装为20份，置于-20°C冷冻保存用作精密度试验。

3.线性：将已经知道甘胆酸浓度的患者的血清进行混合，制备高浓度（约40μg/ml）的一份混合血清，和准备0水平校准品，用于线性试验。

4.灵敏度的确定：采用0水平定标品连续进行10次测定, 采用多个水平校准物里的最低水平（1水平）的样本连续进行3次测定，用作最低检测限的试验。

5.参考范围验证血清：参考文献[4]所述，从2015年9月份某医院健康体检中心体检人群中选择出临床诊断基本正常, 肝功能和肾功能以及脂类项目的结果，还有肿瘤标志物的结果都正常的被检测者的血清，一共50例，用作参考范围的验证。

（二）仪器与试剂

1.仪器：OlympusAU5400全自动生化分析仪（贝克曼库尔特/美国） 。

2.主要试剂：浙江东瓯诊断产品有限公司出品的甘胆酸测定试剂盒(均相酶免疫法)（批号2015060028）、配套校准品CG-S（批号150625 ）、配套质控品（批号150116，150117）。

（三）方法

1.携带污染率：用甘胆酸试剂测定高浓度值血清（约40μg/ml）、去离子水，连续测5天，每天测3次,利用下面的公式计算出每天的携带污染率, 并计算出5天的均值得到平均携带污染率，并确认试剂是否携带污染率达标[5]。样品携带污染率= (空白1浓度-空白3浓度) /(高值1浓度-空白3浓度)×100%。

2.精密度评价：根据CLSI EP15-A文件[6]所提供的方案，用甘胆酸试剂测定出高、低2个水平（甘胆酸浓度约40μg/ml和2.5μg/ml）的混合血清，连续测5天，每天测4次。计算出每个水平的批内和总变异（CV%within、CV%tatal）,还要确认它的不精密度范围是不是与厂商的名义标注的不精密度相符合。

3.线性范围评价：甘胆酸试剂盒标定的线性范围为0.8～50μg/ml，取甘胆酸高浓度血清样本（38.21μg/ml）为H号样本及0水平校准品（理论值为0μg/ml）为L号样本，按1L、1/16H、1/8H、1/4H、1/2H、1H,配制成6个不同浓度梯度的混合血清。每份混合血清测定3次,记录测定结果。按照CLSI EP6-A文件[3]提供的方案进行数据检查，观察有无离群值，判断是否有重复性，然后进行多元线性回归，将其结果拟合1次、2次、3次多项式，最后绘制出散点图并进行评价。

4.灵敏度的确定: 用0水平定标品连续进行10次测定, 用多水平校准物中的最低水平(1水平) 样本连续进行3次测定。通过下面的公式计算出测定下限( LOD) 和定量下限( LOQ) , 比较其与试剂说明书提供的检测下限是否相同，如果高于试剂说明书所提供的检测下限，就要根据临床的需要判断是否可以接受。

式[4]中: A代表0水平原始吸光度的标准差, B代表1水平的浓度,C代表0水平原始吸光度的均值, D代表1水平原始吸光度的均值。

5.参考范围验证：使用试剂测定50份参考范围验证血清中甘胆酸浓度，参考文件[4]进行评价。计算`x±3s, 判断是否有检测值落在`x±3s 以外的, 如果有的话, 将该值去除后再次进行计算, 然后判断现有的参考范围和计算所得的范围是否相符。

（四）统计学分析

用Microsoft Excel 2003及SPSS 16.0软件进行统计学的分析。线性回归用简单线性回归进行分析，以P＜0.05表示回归有统计学意义。

二、结果

1.携带污染率：甘胆酸试剂的平均携带污染率为0.47，符合临床试剂盒的要求。

2.精密度评价：甘胆酸试剂的实际测定精密度小于试剂盒所标注的精密度，变异较小，可以满足临床的应用。

3.线性范围评价：甘胆酸试剂的预期值与实际测定值散点图如图1所示。试剂评价的样品浓度范围为0～38.21μg/ml，数据组里没有明显的离群值，最佳拟合方程为一次多项式。试剂的预期值和实际测定值拟合的相关方程为y=bx+a，其中b=0.9674，a=0.4602，相关系数(r)大于0.975，故试剂的线性范为良好。

图1.甘胆酸的线性图

4.灵敏度：LOD=0.02μg/ml，LOQ=0.10μg/ml，试剂说明书提供的最低检测下限为0.8μg/ml，故此灵敏度符合要求。

5.参考范围验证：入选的50位健康人中，男性25名，女性25名，年龄范围在20～70岁之间。测定50份入选者血清中甘胆酸浓度, 计算`x为1.33，SD为0.44，发现有一个测定值（3.47）落在`x±3s 的外面,除去该测定值之后再次进行计算,判断厂家提供的参考范围和计算所得的范围相符。

三、讨论

甘胆酸（CG）是主要胆汁酸之一，它的代谢是肝脏的一个主要功能。血清甘胆酸是检测肝细胞损伤的敏感性与特异性的指标。有研究显示血清结合甘胆酸放射免疫分析对消化系统生理和病理的研究及临床肝功和肝癌的诊断都有重要意义[7]。除此以外，甘胆酸对妊娠期肝内胆汁淤积症及胆道系统疾病等多种疾病的诊断也都有重要的意义[8]。目前，临床用于评价肝功能的指标有多种，但甘胆酸反映肝细胞的损害比目前临床上常用的ALT（丙氨酸转氨酶）、AST（谷草转氨酶）等更敏感[7]，能早期发现轻度肝损害，对区别慢性肝炎病情严重程度有帮助。有研究显示，急性肝炎患者血清甘胆酸水平与ALT呈正相关；而重症肝炎时，由于酶胆分离，ALT正常，而甘胆酸仍然升高，在肝病转为慢性时，甘胆酸仍保持高水平。因此，甘胆酸的检测也可以作为肝脏疾病诊断和治疗以及预后分析的重要依据。

血清甘胆酸也是妊娠晚期的血清里最主要的胆汁酸成分之一。孕妇正常妊娠时的血清甘胆酸水平会随着孕周期逐渐升高的,直到足月时孕妇甘胆酸的水平都比不怀孕的时候增加30%～60% 。很多研究表明,孕妇中血清甘胆酸的水平由于妊娠期分泌大量雌激素、孕激素和胎盘合成以及代谢负荷的增大,可能会导致肝胆系统的变化[9],孕妇就比较容易患上妊娠肝内胆汁淤积症 。该病患血清甘胆酸水平比正常孕妇高,达10～100倍，该病患增高的血清甘胆酸会增加羊水污染率、早产率、胎儿宫内窘迫率以及剖宫产率,当甘胆酸增高到10 倍以上的时候,以上危险会加大。同时,该病患会出现胆汁排泄障碍，胆汁淤积和胆栓，导致外周循环胆酸堆积，从而血清甘胆酸水平增高，皮肤会出现瘙痒的症状。由于孕妇的血液和羊水里胆汁酸都升高了,还会造成子宫内胎儿出现缺氧，引起早产或者胎儿宫内窘迫等。通过国内的有关报道，得知胎儿宫内窘迫症发生率高达44%～60.6%，早产率也达13%～42.4%[10]。

目前，检测血清甘胆酸含量主要有酶联免疫法和RIA以及化学发光免疫分析法等方法[11]。还有一些不适合广泛应用到临床检验的，如气液色谱、高效液相色谱，以及气相色谱和质谱联用等[12]。

本试验所评估的甘胆酸试剂盒，采用均相酶免疫检测法，能够实现在全自动生化仪器上对甘胆酸的大批量检测及快速化检测，灵敏度高、特异性强。

本次试验参考CLSI文件进行部分调整后对甘胆酸试剂的携带污染率、精密度、线性、最低检测限、参考范围验证等方面进行了性能评价，结果显示该试剂的性能参数能满足临床检测需求，为临床诊断提供可靠的依据。