梓醇对哮喘小鼠气道炎症及AMPK/ROS/NF-κB信号通路的影响

刘嘉研，李俊峰，车 楠，李 莉，姜京植，李良昌

1)延边大学医学院 吉林延吉 133002 2)吉林省科技厅过敏性疾病重点实验室 吉林延吉 133002

哮喘是一种常见的气道炎症性疾病，主要病理特征为气道高反应性、气道平滑肌收缩、气道重塑以及黏液分泌过多，最后导致气流受限和呼吸困难。氧化应激是在体内外有害因素刺激下，体内自由基产生增加或机体抗氧化能力减弱，造成的氧化系统和抗氧化系统失衡[1]。氧化应激介导的信号转导能够诱导气道炎症，导致气道纤维化、平滑肌细胞增殖以及肺部黏液量增加，进一步加重哮喘[2]。因此，调控氧化应激已成为哮喘治疗的研究热点。梓醇是一种从中药地黄中提取的环烯醚萜苷化合物，具有显著的药理作用，能够抑制LPS和IFN-γ诱导的炎症反应，减轻D-半乳糖诱导的衰老小鼠脑内氧化损伤[3]。也有研究[4]证明梓醇通过减轻嗜酸性粒细胞浸润，抑制哮喘炎症。本研究中作者利用卵清蛋白诱导建立哮喘小鼠模型，从氧化应激角度探讨梓醇对哮喘气道炎症的调控作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1药品、试剂和仪器卵清蛋白、ROS检测试剂盒、SOD活性检测试剂盒、MDA检测试剂盒购自美国Sigma公司，白介素(interleukin, IL)-4、IL-5和IL-13 ELISA检测试剂盒购自美国Invitrogen公司，腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)和磷酸化AMPK(p-AMPK)抗体购自美国Cell Signaling公司，NF-κB(p65)、β-actin和PARP(内参)抗体购自美国Santa Cruz公司，梓醇购自中国道斯夫生物公司。402型雾化器(上海四菱医疗器械厂)，分光光度计、酶联免疫检测仪(美国Biotek公司)，气压体积描记室(韩国All Medicus公司)。

1.2哮喘模型建立与分组雌性BALB/c小鼠40只，体重(18±5) g，由延边大学医学部实验动物中心提供，适应性饲养1周后随机分为正常对照组、模型组、梓醇低剂量组、梓醇高剂量组，每组10只。模型组和梓醇低、高剂量组小鼠分别于第1、7、14天腹腔注射200 μL的致敏溶液(含20 μg卵清蛋白+1 mg氢氧化铝)致敏，正常组以等量生理盐水代替。第21天将致敏小鼠置于玻璃罩内，每组以0.1 g卵清蛋白+10 mL生理盐水雾化激发30 min，1次/d，共7 d。梓醇低、高剂量组分别在激发前1 h灌服梓醇50或100 mg/(kg·d)，共7 d。

1.3气道高反应性检测最后一次卵清蛋白激发4 h后，将清醒的大鼠置于体描室，记录3 min内平均基线读数，依次吸入2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 g/L乙酰胆碱20 s，记录3 min内平均读数。计算增强呼气间歇(%)，用以反映气道高反应性。

1.4实验样本获取及支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞检测末次激发48 h后处死小鼠，收集BALF，4 ℃，3 000 r/min离心5 min，取上清液，-80 ℃保存，待测细胞因子。离心沉淀涂片后Diff-quik染色，镜下进行细胞分类。取右肺下叶，用体积分数10%甲醛溶液固定，石蜡包埋后切片，进行HE染色。余肺叶放入液氮中速冻，-80 ℃保存待用。

1.5BALF中IL-4、IL-5和IL-13含量测定按照ELISA试剂盒说明书操作，检测BALF中IL-4、IL-5、IL-13含量。

1.6肺组织中ROS、SOD和MDA的检测取500 mg肺组织样品制备匀浆，根据试剂盒说明书步骤分别用流式细胞术和比色法测定ROS(以平均荧光强度表示)、SOD以及MDA。

1.7肺组织中p-AMPK、AMPK和NF-κB(p65)蛋白表达的检测取肺组织，裂解获取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，每个泳道加样20 μg总蛋白，在120 g/L SDS-PAGE胶上进行蛋白分离(120 V、90 min)，分离蛋白电转移至PVDF膜上。用含50 g/L脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭1 h后，分别加入AMPK、p-AMPK和NF-κB(p65)一抗(分别按1∶500、1∶500和1∶1 000稀释)，4 ℃过夜。洗膜后再加HRP标记的二抗，37 ℃孵育1 h。洗膜，加ECL显色，用Gel Doc进行图像采集。以目的条带与内参条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.8统计学处理采用SPSS 14.0处理数据，应用单因素方差分析和SNK-q检验比较各组小鼠BALF中炎症细胞数目和炎症细胞因子水平，小鼠肺组织中ROS、SOD、MDA含量及AMPK、p-AMPK、NF-κB(p65)蛋白表达水平的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1梓醇对哮喘小鼠气道高反应性的影响4组小鼠气道高反应性检测结果见表1。模型组和梓醇低、高剂量组小鼠气道反应性均高于正常对照组；而梓醇低、高剂量组较模型组降低。

表1 4组小鼠气道高反应性比较 %

*：与正常对照组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05；△：与梓醇低剂量组比较，P<0.05

2.2梓醇对哮喘小鼠肺组织病理学改变的影响HE染色结果(图1)显示，与正常对照组相比，模型组和梓醇低、高剂量组小鼠肺部明显存在炎症细胞浸润、平滑肌增厚和气道黏膜水肿等哮喘病理特征；而与模型组比较，梓醇低、高剂量组上皮细胞增生受抑，炎症细胞浸润减少，黏膜水肿改善。

A、B、C、D：分别为正常对照组、模型组、梓醇低剂量组、梓醇高剂量组

2.3梓醇对哮喘小鼠BALF中炎症细胞数的影响与正常对照组相比，模型组和梓醇低、高剂量组BALF中淋巴细胞数、中性粒细胞数、嗜酸性粒细胞数均升高；与模型组比较，梓醇组小鼠炎症细胞数降低，且梓醇高剂量组更低，见表2。

2.4梓醇对哮喘小鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平的影响结果见表3。模型组和梓醇低、高剂量组BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平高于正常对照组;而梓醇低、高剂量组均较模型组降低，其中高剂量组IL-5和IL-13水平更低。

表2 4组小鼠BALF中炎症细胞数的比较 ×104个/mL

*：与正常对照组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05；△：与梓醇低剂量组比较，P<0.05

表3 4组小鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平的比较 ng/L

*：与正常对照组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05；△：与梓醇低剂量组比较，P<0.05

2.5梓醇对哮喘小鼠肺部氧化应激的影响结果见表4。与正常对照组相比，模型组和梓醇低、高剂量组小鼠肺组织匀浆中ROS和MDA含量升高，SOD活力下降，提示哮喘小鼠肺部存在氧化应激损伤；而与模型组比较，梓醇低、高剂量组小鼠肺组织中ROS和MDA含量下降，SOD活力增强，说明梓醇尤其是高剂量梓醇能够减轻哮喘小鼠肺部氧化应激反应。

表4 4组小鼠肺组织中ROS、MDA含量和SOD活性的比较

*：与正常对照组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05；△：与梓醇低剂量组比较，P<0.05

2.6梓醇对哮喘小鼠肺组织中NF-κB(p65)、p-AMPK表达的影响结果见图2、3，表5。模型组和梓醇低、高剂量组小鼠肺组织中NF-κB(p65)表达水平高于正常对照组，p-AMPK表达水平低于正常对照组；而与模型组比较，梓醇低、高剂量组小鼠肺组织中NF-κB(p65)的表达均降低，p-AMPK的表达均升高，且高剂量组变化更显著。

1～4：分别为正常对照组、模型组、梓醇低剂量组、梓醇高剂量组

图2 4组小鼠肺组织中NF-κB(p65)的表达

1～4：分别为正常对照组、模型组、梓醇低剂量组、梓醇高剂量组

图3 4组小鼠肺组织中p-AMPK的表达

*：与正常对照组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05；△：与梓醇低剂量组比较，P<0.05

3 讨论

哮喘是最常见的慢性非传染性疾病之一，其特征为炎症细胞浸润、气道黏膜水肿、气道上皮剥脱、胶原沉积和反复发作的气道阻塞[5]。哮喘发病过程分泌大量的Th2类细胞因子如IL-4、IL-5和IL-13，这些细胞因子能够趋化嗜酸性粒细胞等炎症细胞，导致气管和气道黏膜下炎症细胞浸润，诱导气道平滑肌收缩，诱发哮喘临床症状。本研究发现，梓醇能够抑制哮喘小鼠肺部炎症细胞浸润，下调BALF中炎症因子IL-4、IL-5和IL-13的水平，减轻肺部病理改变以及气道高反应性，提示梓醇具有抑制哮喘气道炎症的作用。

哮喘进展过程中，由炎症细胞活化产生的过量ROS发挥着关键作用。ROS触发细胞膜上多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，生成MDA等脂质过氧化物。MDA水平越高，代表ROS水平越高，机体损伤越重。正常条件下，机体通过抗氧化酶如SOD等降低ROS水平[4]。本研究发现，哮喘小鼠肺组织中ROS和MDA含量升高，而SOD活性下降，表明哮喘小鼠肺部存在氧化应激，而梓醇能够提高哮喘小鼠肺部SOD活性，降低ROS和MDA含量，提示梓醇能够减轻哮喘小鼠肺部氧化应激反应。

机体内存在调控ROS的多条信号，如核因子E2相关因子2和AMPK等。AMPK是一种丝氨酸苏氨酸激酶，是细胞能量代谢和氧化还原的感受调节器，具有调节氧化应激、抗增殖重塑等生物学功能，是治疗多种疾病的潜在靶位[6]。Faubert等[7]研究表明，AMPK缺陷的小鼠胚胎成纤维细胞线粒体中ROS水平迅速升高。本研究发现，经梓醇治疗后哮喘小鼠肺组织中AMPK磷酸化水平升高，提示梓醇可能通过上调AMPK活性来降低ROS水平。ROS在细胞内信号传导和许多转录因子活性调节中发挥着重要作用，包括缺氧诱导因子-1α、NF-κB和激活蛋白1[8]。NF-κB存在于大多数细胞类型中，并且在免疫和炎症反应中发挥重要作用。炎症条件下，NF-κB由细胞质转位至细胞核中，调控多种编码炎症蛋白的靶基因转录，如炎症因子IL-4、IL-5和IL-13[5]。本研究发现梓醇能够抑制哮喘小鼠肺组织中NF-κB(p65)的表达，提示梓醇可能通过下调ROS水平抑制NF-κB(p65)的表达。

综上所述，梓醇可通过下调AMPK的表达调控ROS的生成，减轻哮喘小鼠肺部氧化应激反应，并通过ROS/NF-κB信号通路调控哮喘小鼠气道炎症因子的释放，抑制哮喘气道炎症。