miR-145通过调控解聚素-金属蛋白酶17对MCF-7乳腺癌细胞的影响

张 兰，郑 健，张雪鹏，胡宝山，李长仔，张晋冀

0 引 言

解聚素-金属蛋白酶17（a disintegrin and metalloproteinase 17，ADAM17）属于ADAM 家族，许多文献报道ADAM17 在恶性肿瘤中表达明显增多，而在正常组织中趋于正常［1-4］。ADAM17 可通过转化某种因子、调节蛋白等多种途径激活表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）配体，进而下游通路发挥作用，从而大大增强了肿瘤细胞的增殖、迁移能力［5-10］。本课题组前期发现通过抑制ADAM17 后，乳腺癌细胞的增殖力和侵袭力均明显下降［11］。研究发现，MicroRNA-145（miR-145）在多种肿瘤中的表达降低，并可通过负性调控ADAM17表达，促进肿瘤细胞的增殖和侵袭；但在乳腺癌中，miR-145对ADAM17的调控作用鲜见报道［1-2］。本研究高表达miR-145后，观察MCF-7细胞增殖、侵袭的变化和对ADAM17、EGFR 的调控，探讨miR-145 通过下调ADAM17 对乳腺癌细胞生物学行为的作用，为ADAM17 成为乳腺癌靶向治疗的潜在靶点提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料MCF-7 细胞株购于中国医学科学院天津血液研究所；miR-145 mimics 及NC 序列由广州锐博公司设计合成。

1.2 细胞培养及分组MCF-7 人乳腺癌细胞在37℃、5%CO2饱和湿度培育箱中常规培育、传代。将MCF-7 乳腺癌细胞分3 组，即转染组（转染miR-145 mimics）、对照组（未行转染）、无义序列组（转染无意义miRNA）。细胞达到80%融合时，转染过程严格按照脂质体Lipofectamine 2000 说明书进行，对照组（加入等体积PBS 缓冲液）、转染组（空白培养基+Lipofectamine 2000+miR-145 mimics）、无义序列组（空白培养基+Lipofectamine 2000+NC-miRNA），转染终浓度为50 nmol/L，转染6 h，继续培养。

1.3 qPCR 检测各组miR-145，ADAM17、EGFR 的mRNA 表达细胞转染48～72 h 后，应用Trizol 法提取细胞总RNA，6 孔板每孔1mL Trizol，充分裂解，静置10 min，加入200 µL 氯仿，混匀，静置3 min，4 ℃，12 000×g，15 min，移出上层水相，加等体积异丙醇，混匀，静置10 min，再次离心，弃去上清，加DEPC 水配制的75%冷乙醇洗涤，离心，弃去上清，充分干燥，DEPC 水10 µL 溶解，RNA 纯度测定260 nm/280 nm 的比值在1.8～2.0 之间时，RNA 纯度能够满足实验要求。PCR引物序列如下：MiR-145：茎环引物 序 列 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGGGAT-3′；上游引物序列5′-CCTCACGGTCCAGTTTTCCC-3′；下游引物序 列 5′CCATGACCTCAAGAACAGTATTTCC-3′；U6：茎 环 引 物 序 列5′-AACGCTTCACGAATTTGCGTG-3′；上游引物序列5′-GCTCGCTTCGGCAGCACA-3′；下 游 引 物 序 列5′-GAGGTATTCGCACCAGAGGA-3′；ADAM17：上 游 引 物 序 列5′-ACCCAGAGTTTTTATGTAGCAGGG-3′；下游引物序列5′-AACTGCCCAGCAAATCAGGG-3′；EGFR：上游引物5′-CTTCTGGAGGGTGAGCCAAG-3′；下游引物5′-GCGATGGACGGGATCTTAGG-3′；β-actin：上游引物5′-CCTCGCCTTTGCCGATCC-3′；下游引物5′-CGTGCTCGATGGGGTACTTC-3′

配制扩增引物、反转录茎环引物，引物储存液、工作液存于-20 ℃冰箱。按逆转录试剂盒的说明合成cDNA，条件为37 ℃，50 min。qPCR 采用20µL 反应体系，条件：95 ℃10 min；95 ℃10 s；56 ℃20 s；72 ℃10 s；进行qPCR 扩增45 个循环。miR-145 以U6 为内参检测相对表达量，ADAM17、EGFR 以βactin为内参检测相对表达量。

1.4 MTT 检测各组MCF-7 乳腺癌细胞的生长、增殖能力MTT 技术的检测时间分别为转染后24、48、72 h，同时检测每个分组波长在490nm处的A值，重复3次，取平均值。细胞抑制率计算公式如下：

细胞抑制率＝（1－实验组A 值/对照组A 值）×100%［12］

1.5 细胞侵袭力测定将细胞重悬以5×105个/mL的浓度接种到Transwell 小室的上室面，下室加入完全培养基，37 ℃、5%CO2饱和湿度培育箱中培育24 h。切取聚碳酸酯膜，苏木精染色，中性树胶封固。高镜下观察，随机均匀取5 个视野进行采图，计数，计算5 个野穿膜细胞数的平均值，3 组实验同时进行。

1.6 ADAM17、EGFR 蛋白表达采用蛋白印迹法测定蛋白表达量，RIPA 法提取细胞总蛋白质，PBS冲洗细胞3次，沥干，加入RIPA 裂解液，冰上充分裂解，离心，吸取上清，BCA 法测定蛋白浓度，随后进行SDS-PAGE 凝胶电泳，每个样本上样量30 µg，浓缩胶电压90 V 约30 min，分离胶电压120 V 约60 min，湿转法转膜200 mA 恒流电转，一抗4 ℃孵育过夜，次日洗膜，二抗摇床孵育2 h，孵育结束后，再次洗膜，而后显色。

1.7 统计学分析采用SPSS 17.0 软件进行统计分析，定量资料以均数±标准差（xˉ±s）表示，使用SNK法。进行两两组间比较，MTT 检测结果采用重复测量资料方差分析。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 qPCR 检 测miR-145 转 染 效 率qPCR 结 果 表明，转染组细胞中miR-145 相对表达量（13 964.33±1 265.30）较对照组（1.00±0.05）和无义序列组（1.03±0.15）明显上升（P＜0.01）。

2.2 MTT 检测细胞增殖抑制率曲线结果表明，随着时间的不断延长，转染组的抑制率明显升高，72 h 达最高峰值。与24、48、72 h 无义序列组比较，转染组MCF-7抑制率明显升高（P＜0.01），见图1。转染组24、48 h A值明显高于对照组和无义序列组（P＜0.05）；对照组72 h A值高于24 h（P＜0.05），无义序列组、转染组48、72 h A 值明显高于组内24 h（P＜0.05），对照组、转染组、无义序列组72 h A 值均高于组内48 h（P＜0.05），见表1。

2.3 细胞侵袭能力乳腺癌细胞MCF-7 转染组穿膜细胞数［（56.20±2.17）个/视野］明显低于对照组［（92.80±3.90）个/视野］和无义序列组［（91.80±4.97）个/视野］的穿膜细胞数（P＜0.01）。见图2。

图1 无义序列组和转染组MCF-7 乳腺癌细胞不同时间点的抑制率Figure 1 Inhibition rates at different time points of nonsense sequence group and transfection group

表1 MTT 检测各组MCF-7 乳腺癌细胞不同时间点的吸光度（xˉ±s,n=6）Table 1 MTT detection of absorbance at three different time points（xˉ±s,n=6）

图2 3组细胞侵袭能力检测结果（HE×200）Figure 2 Results of cell invasion ability test of three groups（HE×200）

2.4 qPCR检测ADAM17、EGFR的mRNA转染组ADAM17 mRNA的表达量明显高于对照组（P＜0.01），但与无义序列组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5 各组细胞中ADAM17、EGFR 的蛋白表达转染组ADAM17、EGFR 的蛋白表达水平与对照组、无义序列组比较明显降低（P＜0.01），见图3，表2。

图3 ADAM17和EGFR蛋白表达量Figure 3 ADAM17 and EGFR protein expression

表2 各组ADAM17、EGFR的蛋白表达值(xˉ±s,n=6）Table 2 Protein expression values of ADAM17 and EGFR(xˉ±s,n=6）

3 讨 论

本课题组前期研究转染ADAM17-shRNA 后，乳腺癌细胞的生长、侵袭及迁移能力明显下降，这一实验结果说明在乳腺癌的发生机制中ADAM17 可能发挥着至关重要的作用［13-14］。本课题组还发现转染ADAM17-shRNA 的骨髓间充质干细胞对裸鼠乳腺癌移植瘤的生长产生明显的抑制作用［15-16］。上述研究表明ADAM17是乳腺癌靶向治疗的潜在靶点。

miRNA 是 一 种 小 的 非 蛋 白 质 编 码RNA［17-19］，miRNA 在细胞生长、自然死亡、机体代谢、个体发育、肿瘤各个方面起到重要作用，与生命活动密切相关。相关文献报道miR-145在多种肿瘤中呈现低表达状态，和抑癌基因作用相似，其在消化道恶性肿瘤、肺癌、卵巢癌等多种肿瘤中有着显著的抑制作用［20-22］。包括乳腺癌在内，有研究发现miR-145在乳腺恶性肿瘤中呈低表达，并且miR-145 与实体瘤大小、淋巴结转移呈负相关［23］。有研究通过构建病毒载体转染miR-145模拟双链寡核苷酸成功的降低了体内及体外系统中乳腺癌细胞的生长、运动，证实miR-145在乳腺恶性肿瘤的发生机制中起到调控作用，另外，联合使用抗肿瘤药物5-FU时，乳腺癌细胞的生长受到更显著的抑制作用［24］。

通过靶基因预测数据库进行靶基因预测，发现miR-145 与ADAM17 存在相对稳定的碱基互补序列，这说明ADAM17 可能受miR-145 的直接调控。另外，靶基因预测数据库中并未发现miR-145 与EGFR 之间存在匹配碱基对，说明EGFR 不是miR-145的靶基因，不受miR-145的直接调控。李雪等［25］通过miR-145 mimics 转染转化生长因子β1 诱导的人脐静脉内皮细胞，发现miR-145 负性调控ADAM17 并且能够抑制间质转化的过程。Jing 等［26］在鼻咽癌中通过荧光素酶报告基因检测、qPCR 及蛋白印迹证实miR-145 与ADAM17 存在靶向关系，并且证明了miR-145可以靶向调控ADAM17来抑制鼻咽癌细胞的增殖及侵袭。本研究主要是探究高表达miR-145与ADAM17、EGFR的关联，探讨miR-145对MCF-7 乳腺癌细胞增殖、侵袭能力的影响。本研究通过将miR-145 模拟物导入MCF-7 细胞，调高MCF-7 细胞中miR-145 的水平，发现细胞的生长能力及侵袭能力明显降低，这说明miR-145 能够显著抑制MCF-7 乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力。本研究发现转染miR-145 mimics 后ADAM17mRNA 表达量上调，但ADAM17 蛋白的表达水平下降，表明尽管miR-145 mimics 对ADAM17mRNA 的转录有影响，但在翻译水平对ADAM17 的蛋白表达有抑制作用。因为最终发挥功能作用的为蛋白，故miR-145对ADAM17 有抑制作用。因为EGFR 与miR-145 之间不存在互补碱基，所以本研究中miR-145 mimics对EGFR mRNA 无直接调控作用。但本课题组前期研究发现ADAM17可调控EGFR的表达，故miR-145是通过ADAM17抑制EGFR的蛋白表达水平［27］。

综上所述，miR-145 能通过靶向抑制ADAM17-EGFR 通路，从而抑制MCF-7 乳腺癌细胞的增殖、侵袭能力，并进一步验证了ADAM17 有可能成为乳腺癌靶向治疗新靶点。