严重发热伴血小板减少综合征病毒对小鼠巨噬细胞Toll样受体2及炎性因子表达的影响

颜莹莹，朱旭辉，胡南南，刘 源，朱 进，金 柯，韩亚萍，李 军

0 引 言

严重发热伴血小板减少综合征（severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS）是一种新型的传染病，由布尼亚病毒科白蛉病毒属的严重发热伴血小板减少综合征病毒（severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV）引起［1］。SFTS 的主要临床表现包括急性发热（≥38 ℃）、血小板减少、白细胞减少、胃肠道症状等，重症患者会出现多器官功能衰竭［2-3］。目前，我国该病的病死率为6%～30%［4］。

SFTS 的传播主要是通过蜱虫叮咬［7］，另有研究证实SFTS 也可以通过与受感染者的血液或分泌物密切接触而发生［5-6］。而且，人群对SFTSV 普遍易感。根据中国疾病预防控制中心的报道，我国共有23个省市报告SFTS病例［7］；日本、韩国、朝鲜、美国、印度也有类似病例［8-10］。相关报道显示，该病发病有逐年升高的趋势［4］。由此可见，SFTS 流行地域广并且人群普遍易感，值得我们进一步研究。

既往研究结果显示SFTS 患者血清中干扰素-α（interferon-α，IFN-α）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）、干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）、巨噬细胞炎性蛋白1α（macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）IL-10、干扰素诱导蛋白10（interferon-inducible protein-10，IP-10）、单核细胞趋化蛋白1（Monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）等因子的表达水平明显高于健康人；此外，重症患者血清中IFN-α、IFN-γ、G-CSF、MIP-1α、IL-6 和IP-10表达水平明显高于轻症患者［11-13］，由此可见炎性因子的分泌水平与SFTS的严重程度密切相关。其中，TNF-α、IL-6 和MCP-1 等促炎因子的合成主要依赖核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）/Toll 样受体（Toll-like receptors，TLR）信号通路［14］，SFTSV 感染单核细胞后会引起NF-κB 信号通路的调控失衡进而导致炎性因子分泌的紊乱。有研究显示，SFTS严重程度与患者骨髓树突状细胞和单核细胞中Toll样受体3（Toll-like receptor 3，TLR3）表达降低相关［15］。但目前，尚未确定机体免疫系统尤其是巨噬细胞、TLR是如何参与SFTSV的识别，以及如何引起炎性因子风暴的。

本研究旨在探索SFTSV 感染小鼠原代腹腔巨噬细胞后TLR2 和炎性因子表达水平的改变情况，从而为进一步阐明炎性因子在SFTSV 感染致病中的作用及其机制提供理论依据和实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂SFTSV JS14 株由江苏省疾病预防控制中心提供。非洲绿猴肾细胞（Vero 细胞）为本实验室保存。RPMI-1640 培养基、胎牛血清购自美国Gibco 公司；RNA 提取试剂盒购自上海飞捷生物技术有限公司；cDNA 合成试剂盒、SYBR green 试剂盒购自宝日医生物技术（北京）有限公司。TNFα、IL-6 和IL-10 炎性因子检测试剂盒购自Multisciences 公司，IFN-β 试剂盒购自Elabscience 公司。荧光定量PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成，PCR 的引物序列如下，TLR2 上游引物（5′-ATCCTCCAATCAGGCTTCTCT-3′），下游引物（5′-GGACAGGTCAAGGCTTTTTACA-3′）；TNF-α 上 游引物（5′-GACGTGGAACTGGCAGAAGAG-3′），下游引物（5′-TTGGTGGTTTGTGAGTGTGAG-3′）；IFN-β上游引物（5′-CAGCTCCAAGAAAGGACGAAC-3′），下游引物（5′-GGCAGTGTAACTCTTCTGCAT-3′）；IL-6上游引物（5′-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3′），下游引物（5′-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3′）；IL-10 上游引物（5′-CTTACTGACTGGCATGAGGATCA-3′），下游引物（5′-GCAGCTCTAGGAGCATGTGG-3′）；β-actin 上游引物（5′-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3′），下游引物（5′-GCAGCTCAGTAACAGTCCGC-3′）。BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。兔抗TLR2 单克隆抗体购自美国Cell Signaling 公司。Tanon 5200 全自动化学发光图像分析系统（上海天能公司）用于检测Western条带信号。

1.2 小鼠腹腔巨噬细胞的收集与提取选6～8 周龄的C57BL/6J 小鼠，腹腔注射4%巯乙基淀粉肉汤3 mL/只，3 d 后脱颈处死，用RPMI-1640 培养基冲洗腹腔，重悬离心后计数铺板，24 孔板3×105个/孔，6 孔板1.5×106个/孔。细胞培养选用培养基为含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中进行培养，3 h 后换液去除未贴壁的细胞，贴壁细胞即为小鼠腹腔巨噬细胞。感染复数（Multiplicity of infection，MOI）代表了感染时病毒与细胞数量的比值。预实验结果显示，MOI=0.5、MOI=1 和MOI=2的SFTSV 均可诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生细胞因子，且细胞因子的表达水平在MOI=2 时最高。为更好地观察病毒感染细胞后不同时间点炎性因子水平的变化，随后用MOI=2 的SFTSV 量感染小鼠腹腔巨噬细胞。

1.3 SFTSV 接种小鼠腹腔巨噬细胞取SFTSV 接种每孔细胞，感染后0、6、12、24、36、48、72 h 收获细胞和培养上清，一部分细胞用于荧光定量PCR 检测TLR2和细胞因子mRNA的表达，另一部分细胞用于Western blot 检测TLR2 蛋白表达；培养上清用于ELISA检测细胞因子的表达。

1.4 荧光定量PCR 检测用SFTSV 感染小鼠腹腔巨噬细胞，2h 后换液并继续培养细胞，收集SFTSV感染后第0、6、12、24、36、48、72 小时的小鼠腹腔巨噬细胞提取总RNA，逆转录成cDNA 用作荧光定量PCR 模 板，在LightCycler 2.0（Roche Diagnostics，CA，USA）上进行扩增，反应条件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，58 ℃15 s，72 ℃30 s，40 个循环。反应完成后以目的基因的CT 值减去内参β-actin 的CT 值为△CT，以2-△△CT方法分析目的基因相对表达量。

1.5 Western blot 法检测用SFTSV 感染小鼠腹腔巨噬细胞，2 h 后换液并继续培养细胞；分别在感染后6、12、24、36、48 和72 h 收集细胞，细胞先用无菌预冷PBS 洗2 次，吸弃PBS，加入细胞裂解液、磷酸酶和蛋白酶抑制剂，充分裂解混匀，冰上静置30 min；4℃，12 000×g 离心10 min，吸取上清用BCA 法测定总蛋白浓度。40 µg 总蛋白上样跑胶结束后，恒流300 mA 转膜约1 h，5%脱脂奶中封闭37 ℃1 h，加入抗TLR2 单克隆抗体4 ℃孵育过夜，洗膜，室温孵育羊抗兔二抗1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min。NC膜于室温下ECL显色。

1.6 ELISA 法检测用SFTSV 感染小鼠腹腔巨噬细胞，2 h 后换液并继续培养细胞；分别收集感染后0、6、12、24、36、48 和72 h 的细胞培养上清，根据ELISA 试剂盒说明书检测TNF-α、IFN-β、IL-6 和IL-10 的表达水平。简要操作：首先将各试剂平衡至室温。分别设空白孔、标准孔、待测样品孔并加样，37 ℃孵育90 min。弃去液体，甩干，每个孔中加入Detection Ab 工作液100 µL，37 ℃温育1 h。弃去孔内液体，甩干，洗板3 次。每孔加HRP Conjugate 工作液100 µL，37 ℃温育30 min。弃去孔内液体，甩干，洗板5 次。每孔加底物溶液90µL，37 ℃避光孵育15 min。最后每孔加终止液50µL，终止反应，待蓝色转为黄色时立即用酶标仪在450 nm 波长测量各孔的A值。

1.7 统计学分析采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，定量资料以（xˉ±s）表示，各组间均数比较采用t检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SFTSV 感染小鼠腹腔巨噬细胞后炎性因子表达qPCR结果显示，0～72 h感染的小鼠腹腔巨噬细胞生成的TNF-α和IFN-β mRNA水平呈现先上升（24 h最高）后下降的趋势，与0 h比较，其余时间点TNF-α和IFN-β mRNA水平差异均有统计学意义（P＜0.05）；而IL-6和IL-10 mRNA则呈现持续升高，与0 h比较，其余时间点差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 SFTSV 感染小鼠腹腔巨噬细胞的培养上清中TNF-α、IFN-β、IL-6 和IL-10 的分泌水平ELISA结果显示4 种炎性因子的表达均呈逐渐升高的趋势，24、36、48、72 h 均较0 h 明显升高（P＜0.05）。见表2。

表1 SFTSV 刺激小鼠原代腹腔巨噬细胞后炎性因子的mRNA相对表达量（xˉ±s，n=3）Table 1 Relative mRNA expression of inflammatory factors after SFTSV stimulation of primary peritoneal macrophages in mice（xˉ±s，n=3）

表2 SFTSV 刺激小鼠原代腹腔巨噬细胞后炎性因子的蛋白分泌水平（xˉ±s，pg/mL，n=3）Table 2 Protein secretion of inflammatory factors after SFTSV stimulation of primary peritoneal macrophages in mice（xˉ±s，pg/mL，n=3）

2.3 SFTSV 感染小鼠腹腔巨噬细胞后TLR2 的表达结果显示，感染的小鼠腹腔巨噬细胞生成的TLR2 mRNA 表达均呈现先上升后下降的趋势，在24 h 上升达到最高水平，6、12、24、36、48、72 h 与0 h相比差异均有统计学意义（P＜0.01），见图1。TLR2蛋白在感染后随着时间延长表达逐渐升高，提示SFTSV感染可以刺激TLR2蛋白表达，且随着刺激时间延长累积表达量逐渐升高，见图2。

图1 小鼠原代腹腔巨噬细胞中TLR2的表达Figure 1 Expression of TLR2 in primary peritoneal macrophages of mice

图2 TLR2蛋白表达水平Figure 2 Protein expression level of TLR2

3 讨 论

本研究首先观察了SFTSV 对小鼠腹腔巨噬细胞炎性因子产生的影响，结果表明，SFTSV明显促进了炎性因子TNF-α、IFN-β、IL-6 和IL-10 的分泌，且具有剂量依赖性。有学者对SFTS 患者体内的炎性因子进行研究，结果表明SFTS 患者TNF-α、IL-6、IL-10、IFN-α和IFN-γ表达明显高于健康人［11］。另一个研究报道SFTS患者体内IL-6和TNF-α明显升高，而IFN-β 表达则是下降的［15］。本实验中IFN-β mRNA和蛋白水平在感染后是升高的，这一差别可能是由于本研究观察的只是病毒对小鼠腹腔巨噬细胞的影响，机体有多种不同的免疫细胞，患者血清细胞因子的表达水平是多种免疫细胞综合作用的结果。本实验中TNF-α和IFN-β mRNA 于病毒感染后第24小时达到高峰，之后出现下降，但在培养上清中TNF-α 和IFN-β 蛋白表达则随时间的延长逐渐增高。对此mRNA 转录和蛋白质表达时间不同步的现象，我们推测是由于真核基因的转录和翻译存在时空间隔，mRNA 与蛋白质表达水平之间的关系并不是严格的线性关系，而是一种更为复杂的依赖关系，不同的调控机制（如合成和降解速率）作用于合成的mRNA和蛋白，对表达量会有不同的影响［16］。

本研究结果表明，SFTSV 感染小鼠腹腔巨噬细胞后TLR2 mRNA 表达升高较为明显，在第24 小时升高达到顶峰。Western blot 结果显示TLR2 蛋白表达随感染时间延长而逐渐增多。提示SFTSV 刺激小鼠腹腔巨噬细胞可上调TLR2 的表达。有研究表明TLR2 在登革热病毒感染者的PBMC 中表达上调［17］，说明TLR2 在识别登革热病毒中发挥重要的作用。H1N1、RSV和成人社区获得性肺炎常见病毒可激活TLR2 胞内信号转导途径，本研究结果中TLR2 表达升高，与其研究结果相似［18-20］。这些都提示TLR2 在病毒感染中发挥重要作用，在病毒感染后TLR2 激活下游信号转导通路，诱导关键炎性因子如IFNs 的产生［21］。有研究提示汉坦病毒的基因重排将对病毒的毒力变化有所影响，对于与汉坦病毒相似的SFTSV 则需要进一步研究［22］。另一结果显示巨噬细胞在机体早期防御烟曲霉感染中发挥着重要作用，而且通过增强其作用，可加强巨噬细胞的吞噬和杀灭作用［23］。因此，评估在TLR2 存在或不存在时巨噬细胞对SFTSV 感染的反应是一项重要的工作。本研究接下来将对巨噬细胞的TLR2表达进行下调或阻断，再观察各炎性因子的变化。

SFTSV可以通过调节信号通路来促进炎症基因的表达，引起的炎性因子风暴是SFTS发生发展的重要原因。本研究证实SFTSV 感染能促进巨噬细胞上调TLR2 的表达，可能导致炎性因子分泌增加，为寻找治疗SFTS的靶点提供了实验依据。