黄体酮对雄性大鼠脑出血后的神经保护作用机制

左清娇，郑晓梅，涂 婷，先 耀，周子薇

0 引 言

卒中已经成为中国人第一死因［1］，出血性脑卒中病死率高、治愈率低，易遗留不同程度的神经功能障碍而影响患者的身心健康。脑出血的损伤机制主要有：血肿的直接占位效应、脑出血后继发脑水肿、炎症反应和细胞凋亡等［2-3］。如何有效降低脑出血后脑水肿和抑制炎性反应，已经越来越受到重视。既往研究发现黄体酮对脑梗死、蛛网膜下腔出血等脑损伤有神经保护作用，能减轻血脑屏障破坏和脑水肿、抗炎、抗神经元凋亡等［4-5］。但黄体酮对脑出血是否有神经保护作用的研究国内外较少，现对脑出血大鼠模型予以黄体酮干预，观察其对脑出血后脑组织含水量、神经功能评分及基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）和核转录因子κB（nuclear factor-κB ，NF-κB）表达水平的影响，探讨其对脑出血大鼠是否有神经保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂选取174只成年雄性SD大鼠，体重约（250±20）g，购自成都达硕实验动物有限公司，试验动物合格证号：scxk（川）2015-030，标准条件下饲养：温度20～28 ℃，12 h 光照周期，标准饲料喂养和自由饮水。黄体酮（美国Sigma公司），DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），MMP-9和NF-κB 抗体（英国abcam 公司），MMP-9 抗体和GAPDH抗体（英国abcam公司），NF-κB抗体（美国CST公司），HRP标记山羊抗兔抗体（美国ASPEN公司）。

1.2 方法

1.2.1 脑出血造模6%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，俯卧位固定大鼠于脑立体定位仪上（深圳瑞沃德生命科技有限公司），暴露前囟，矢状缝右侧旁3 mm，前囟后0.2 mm，深6 mm 处为右侧尾状核部位，颅骨钻孔，断尾取血，采用“改良二次注血法”注血，第1 次注血20 µL 匀速注入，留针7 min，第2次注血30 µL 匀速注入，留针10 min，退针，缝合、消毒，假手术组操作方法相同，但不注血。采用Longa5 级评分法进行神经功能评分，1～3 分视为造模成功［6］。

1.2.2 分组与给药174 只成年雄性SD 大鼠随机数字表法分为6组：假手术组，模型组，溶剂组，黄体酮低、中、高剂量组，每组29 只。将黄体酮粉末溶于22.5%羟丙基-β-环糊精溶剂中。黄体酮治疗组于脑出血后2、6 h腹腔注射黄体酮溶液（4、8、16 mg/kg），剂量选择参考文献［7］的实验方法，之后每日1次皮下注射；溶剂组给予等体积的HBC，假手术组和脑出血组给予等体积等渗盐水。

1.2.3 神经功能评分给药后1、3、7 d 对各组大鼠进行神经功能评分，参照改良Garcia 评分方法，评估神经功能损伤及恢复情况。分数越高表示损伤越轻，分数越低表示损伤越重［8］。

1.2.4 脑组织含水量（water content brain,BWC）测定深度麻醉大鼠，断头取脑，称量湿重，烘烤箱内烘烤，称量其干重，采用干湿重法计算脑组织含水量［9］，公式如下：

含水量＝（湿重-干重）／湿重×100%

1.2.5 免疫组化检测MMP-9 和NF-κB 的表达步骤简述如下：①烘片脱蜡至水，PBS 冲洗，切片于EDTA 缓冲液中微波加热行抗原修复，PBS 冲洗；②于3%过氧化氢溶液中10 min 将内源性过氧化物酶灭活，③PBS 漂洗，5%BSA 封闭20 min，加一抗覆盖组织，4 ℃过夜，PBS 漂洗，加二抗37 ℃孵育50 min，PBS 漂洗；④用DAB 溶液在显微镜下控制显色；⑤冲洗、复染、梯度乙醇脱水、透明、封固。应用Image ProPlus 6.0 专业图像分析软件测量MMP-9 和NF-κB的累积光密度值（IOD），对MMP-9 和NF-κB 蛋白的表达进行半定量分析。

1.2.6 Western blot 检测脑组织MMP-9和NF-κB蛋白的表达步骤简述如下：①造模后3d 处死大鼠，取脑组织于-80 ℃冰箱保存；②提取蛋白，BCA法检测蛋白浓度；③SDS-PAGE 电泳、转膜、封闭，除去封闭液，加入一抗和GAPDH 4 ℃孵育过夜，用TBST 洗3 次，加入二抗（HRP 标记的山羊抗兔），室温孵育30 min，用TBST 在室温下摇床上洗4 次；④滴加增强型发光试剂（ECL），曝光、显影、定影；⑤胶片存档，使用AlphaEaseFC 软件处理系统，GAPDH作为内参，目的条带的灰度值/GAPDH 条带的灰度值分析蛋白表达情况。

1.3 统计学分析采用SPSS23 软件进行统计分析，定量资料以均数±标准差（xˉ±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较采用LSD 检验，以P≤0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠的神经功能评分比较与假手术组比较，其余各组各时间点神经功能评分降低（P ＜0.01）。模型组和溶剂组神经功能障碍差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组、溶剂组比较，黄体酮低、中、高剂量组各时间点神经功能评分增高，以中剂量组最明显（P ＜0.05），见图1。

2.2 脑组织含水量比较与假手术组相比，其余各组各时间点大鼠脑组织含水量明显增加（P ＜0.01）。模型组和溶剂组脑组织含水量差异无统计学意义（P＞0.05）。黄体酮低、中、高剂量组各个时间点脑组织含水量较模型组和溶剂组降低（P ＜0.01），中剂量组最明显（P ＜0.05），见表1。

2.3 各组大鼠脑组织MMP-9、NF-κB 蛋白表达测定结果与假手术组相比，其余各组MMP-9、NF-κB蛋白表达明显增加（P ＜0.01）。模型组和溶剂组脑组织MMP-9、NF-κB 蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。黄体酮低、中、高剂量组MMP-9、NF-κB蛋白表达较模型组和溶剂组降低（P ＜0.01），黄体酮中剂量组最明显（P ＜0.05）。见表2。模型组和溶剂组见大量MMP-9阳性细胞表达，细胞质棕黄色深染，NF-κB阳性细胞棕黄色，主要分布在细胞核，黄体酮各组MMP-9、NF-κB 阳性细胞表达较模型组和溶剂组少，免疫组化检测结果见图2、图3。Western blot显示与假手术组比较，其余各组MMP-9、NF-κB蛋白表达增高（P ＜0.01）；黄体酮低、中、高剂量组MMP-9、NF-κB蛋白表达较模型组和溶剂组降低（P ＜0.01）。见表3，图1。

图1 各组大鼠各时间点神经功能缺损评分Figure 1 Neurological severity scores of different groups of rats at different days

表1 各组不同时间大鼠脑组织含水量的比较（xˉ±s，%）Table 1 Comparison of brain water content in rats at different time points（xˉ±s，%）

表2 免疫组化测定各组大鼠脑组织不同时间点MMP-9、NF-κB蛋白表达的变化（xˉ±s）Table 2 Expression of the MMP-9，NF-κB protein in the brain tissue of different groups of rats at different time points by immunohistochemistry（xˉ±s）

图2 镜下观察各组大鼠脑组织中MMP-9表达情况（免疫组化染色×400）Figure 2 1d The expression of MMP-9 in brain tissue of each group（IHC×400）

图3 各组大鼠脑组织中NF-κB表达情况（免疫组化染色×400）Figure 3 The expression of NF-κB in brain tissue of each group（IHC×400）

表3 Western blot 法测定各组大鼠脑组织内MMP-9、NFκB蛋白表达水平（xˉ±s）Table 3 Expression of MMP-9, NF-κB in the brain tissue by western blot assay（xˉ±s）

图4 Western blot 检测各组大鼠脑组织内MMP-9、NF-κB蛋白表达Figure 4 The expression of MMP-9 、NF-κB in brain tissue of each group bywestern blot assay

3 讨 论

目前脑出血后的脑损伤机制尚不明确，大量研究表明脑出血后脑水肿和炎性反应在继发性脑损伤中起着重要作用。血脑屏障的完整性对于维持脑内环境稳定是必不可少的，MMP-9是基质金属蛋白酶重要成员，大量研究表明MMP-9 通过参与紧密连接蛋白和微血管基底膜蛋白的降解破坏血脑屏障，导致脑水肿［10］。应用MMP-9 抑制剂可保护血脑屏障、减轻脑水肿［11］，减轻脑出血后脑水肿有利于神经功能恢复［9］。同时MMP-9 也是炎性介质之一，NF-κB 是一种能够调控多个炎性相关基因转录表达的重要转录调节因子，有研究表明MMP-9 启动子区域存在NF-κB 转录因子结合位点，可通过NFκB 信号通路调节MMP-9 表达，抑制NF-κB 活性可降低MMP-9 的表达，抑制炎症反应［12-13］。脑血管内皮细胞、神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞等均可表达NF-κB，脑出血后NF-κB活化，上调多种炎性因子表达［14］。而这些炎症因子又是NF-κB 的激活剂，反过来增强NF-κB 转录，导致持续和增大炎症反应［15］。NF-κB 可能是脑出血后炎症反应的关键环节。

黄体酮是一种安全性好、不良反应少，可透过血脑屏障的神经甾体［16］。大量研究表明黄体酮对中枢神经系统的调节起着重要作用，在蛛网膜下腔出血中，黄体酮可抑制凋亡，减少氧化应激，减轻急性脑损伤［5］，在脑梗死中，黄体酮可减少炎症反应和神经细胞凋亡，促进血管新生，改善大鼠神经功能［17］。有研究发现黄体酮能通过降低血管内皮生长因子和MMP-9 表达，保护血脑屏障和减轻脑水肿，延长缺血性卒中组织型纤溶酶原激活剂给药的时间窗口并减少出血性转化［18］。有研究发现，黄体酮能降低中年雄性小鼠脑出血后病变体积，改善脑水肿，减轻炎症反应，改善神经功能损伤［19］。黄体酮对雄性大鼠脑出血是否有治疗作用，目前国内外研究较少。

本实验通过建立大鼠脑出血模型探讨黄体酮是否对大鼠脑出血后有神经保护作用以及其机制，结果显示：模型组大鼠MMP-9、NF-κB蛋白的表达较假手术组明显升高，脑组织含水量升高，脑出血后大鼠出现神经功能缺损，黄体酮低、中、高剂量组MMP-9、NF-κB 蛋白表达较模型组明显下降，脑组织含水量也降低，神经功能缺损有所改善。黄体酮可能通过降低MMP-9 表达，减轻血脑屏障的破坏，减轻脑水肿，下调炎症相关蛋白NF-κB 表达，可能抑制其介导的炎性反应，减轻继发性脑损伤，从而发挥神经保护作用。

黄体酮可能是一种有效的神经保护剂，但需进一步了解黄体酮在治疗脑出血方面作用机制，才能提高其转化为一种治疗脑出血药物的可能性。