人脑胶质母细胞瘤细胞系U87的单克隆细胞构建及异质性研究

蒋迎娣，殷 莹，浦浙宁，张 博，龚玲丽，胡亚玲，纪 丽，汪京京，张真豪，邹 健

0 引 言

胶质母细胞瘤（Glioblastoma，GBM）是人脑最常见的肿瘤。其主要特点是高增殖性和侵袭性，肿瘤无明确边界，极易复发，平均中位生存时间仅15 个月［1-3］。目前，GBM 主要治疗手段是手术切除联合放化疗。而替莫唑胺作为一线化疗药有效率仅为45%左右，虽能在短期内提高患者生存时间，但由于肿瘤异质性的存在最终产生耐药而导致肿瘤复发［4-6］。GBM 是一种典型的具有高度异质性的肿瘤，肿瘤组织中细胞、基因的时空异质性是产生耐药和复发的分子基础［7-9］。人胶质母细胞瘤细胞细胞系U87是被广泛使用的一种GBM 工具细胞系，在体外培养条件下存在多种形态，如典型的细长形细胞和短梭形细胞，因此U87也被作为GBM异质性研究的模型［10］，但从基因水平探讨其异质性来源的研究较少。本研究旨在构建人胶质母细胞瘤细胞系U87 单克隆细胞株，经鉴定后检测不同单克隆细胞株的表型和遗传背景差异，并探讨产生表型差异的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料人胶质母细胞瘤细胞系U87 购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，并由本实验室扩增和保存。DMEM 培养基、D/F12 培养液、青霉素-链霉素双抗混合液和0.25%胰蛋白酶溶液购自美国HyClone 公司；胎牛血清购自以色列Biological Industries 公司；细胞培养板、培养皿以及鼠尾胶原I购自美国Corning公司；细胞爬片购自上海卧宏生物科技有限公司；3D细胞侵袭装置购买于美国AIMBiotech Pte Ltd 公司；B-27、GlutaMAX 添加剂、重组人表皮生长因子、10×PBS、鼠单克隆抗体Beta-tubulin、驴抗鼠荧光二抗Alexa Flour 488 和Hoechest 33342购自美国ThermoFisherScientific 公司；牛血清白蛋白、Fluoromount 封片剂、曲拉通（TritonX-100）、酚红钠盐和TRIzol试剂购自美国Sigma公司；CCK-8检测试剂盒购自美国Bimake 公司；kFluor555-EdU 法细胞增殖检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 细胞凋亡流式检测试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；逆转录试剂盒HiFiScript cDNA Synthesis Kit 购自北京康为世纪生物科技有限公司；鬼笔环肽购自美国Cell Signaling Technology 公司；阿霉素购自美国Selleck公司；驴血清购自美国Jackson ImmunoResearch 公司；CFSE 购自英国Abcam 公司；4%多聚甲醛溶液（4%PFA）和结晶紫染色液购自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 单克隆细胞株的筛选U87 细胞培养于含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM 完全培养基中，于37℃、5%CO2条件下培养。取对数生长期U87 细胞，经CFSE 染色后计数并进行梯度稀释制成细胞密度为100 个/mL 的细胞悬液，以每孔100 µL 接种于96 孔板中，合计4 个96 孔板，待细胞贴壁后在荧光显微镜下观察，选出仅有单个细胞的培养孔，作扩大培养并冻存保种，并根据单克隆化的细胞形态特征，最终选取2 株典型特征的细胞（分别命名为CF5和G11）作为后续研究的对象细胞。

1.2.2 免疫荧光染色实验检测细胞形态实验前将经包被处理过的细胞爬片放入24孔板中，取对数生长期的U87、CF5 和G11 细胞，消化后计数。以2×104/孔种于爬片，37 ℃培养箱培养24 h 后4%PFA 固定15 min，用 含0.3% Triton-X 100 的PBS 通 透15 min，驴血清室温封闭1 h 后将鼠抗Beta-tubulin 加入爬片，4 ℃孵育过夜，经PBS 洗涤后加入驴抗鼠Alexa Flour 488 二抗室温孵育1 h，PBS 洗涤3 次后用含Hoechst 33342 的Fluoromount 封片剂封片，荧光显微镜下观察细胞形态并拍照。

1.2.3 CCK-8 法和EdU 掺入成像法检测细胞增殖能力取对数生长期的U87、CF5 和G11 细胞，消化后计数，以1000/孔接种于96孔板，每组设6个复孔，分5 个时间点（第0、24、48、72、96 小时）检测。每100 µL DMEM 完全培养基中加入10 µL CCK-8 试剂，37 ℃培养箱内孵育2 h，用多功能酶标仪检测各孔在450nm 波长下吸光度值（A），以第0 天即接种4 h后的A值为1，绘制细胞生长曲线。

取对数生长期的U87、CF5 和G11 细胞，消化后计数，以2×104/孔接种于细胞爬片，每组设3 个复孔。以完全培养基培养24 h 后换为含有10µmol/LEdU 完全培养基，37 ℃培养箱继续培养3 h，PBS 洗 涤 后4%PFA 室 温 固 定15 min，用 含3%BSA-PBS 洗 涤3 次，0.3%Triton-X 100-PBS 室 温破膜20 min 后洗涤3 次。根据试剂盒说明书配置Click-iT 染色液，室温避光孵育30 min，3% BSAPBS 洗涤3 次后用含Hoechst33342 的Fluoromount封片剂封片后，荧光显微镜下拍照，并用Image J软件统计阳性细胞比例。

1.2.4 平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力取对数生长期的U87、CF5 和G11 细胞，消化后计数，以1000/孔接种于6 孔板，每组设3 个复孔，37 ℃培养箱连续培养14 d，4%PFA 室温固定15 min，PBS 洗涤3 次，10%结晶紫染色15 min，洗涤后空气干燥，倒置显微镜下计数每组细胞的克隆形成数（＞50 个细胞为1 个克隆）。

1.2.5 干细胞样细胞成球实验检测细胞成球能力取对数生长期的U87、CF5和G11细胞，消化后计数，用神经干细胞培养液（由D/F12 培养液中加入20 ng/mL EGF、20 ng/mLbFGF、B27 和2 mmol/L GlutaMAX配制而成）培养细胞。细胞以5000/孔接种于低吸附6孔板，每组设3个复孔，37 ℃培养箱连续培养15 d，用EVOSTM FL Auto 细胞成像系统拍照，Image J软件统计的细胞球个数及直径（＞50µm为1个克隆球）。

1.2.6 免疫荧光法和CCK8 法黏附实验检测细胞黏附能力取对数生长期的U87、CF5 和G11 细胞，消化后计数，以2×104/孔接种于细胞爬片，每组设3个复孔。37 ℃培养箱培养1 h，取出爬片用PBS洗去未黏附的细胞，4% PFA 固定15 min，0.3%TritonX-100-PBS 通透20 min 后，用DyLight™554 Phalloidin室温孵育20 min，经PBS 洗涤后用含Hoechst33342的Fluoromount 封片剂封片，每张爬片随机选取10个视野荧光显微镜拍照，并用Image J软件统计每个细胞黏附面积。

将对数期生长的U87、CF5 和G11 细胞以2×104/孔接种于96 孔板，每组设6 个复孔，实验参照文献［11］，37 ℃培养1 h 后用PBS 清洗未黏附的细胞，并加入CCK-8 试剂检测吸光度A 值，以黏附细胞吸光度A 值与总细胞A 值的比值计算黏附率，并将U87细胞黏附率设为1。

1.2.7 3D 侵袭实验检测细胞侵袭能力参照文献［12-13］配制2.0 mg/mL 鼠尾胶Collagen I（由10×PBS、NaOH、鼠尾胶以及双蒸水配制而成）。将胶从3D侵袭装置中间孔加入，37 ℃培养箱放置30 min使其凝固。以DMEM 水化3D 装置中Collagen I 左右两侧通道，左侧通道上下2 个孔各加70µL DMEM，并在左侧通道入口处加入20 µL 上述细胞悬液，右侧通道2 个孔也各加入70 µL DMEM 培养基，将装置放入37 ℃培养箱继续培养2 h 后，将右侧无细胞通道侧的DMEM培养基更换为含20%FBS的DMEM培养基，形成血清浓度差，放回培养箱继续培养72 h。用PBS 洗涤3 次后固定通透，DyLight™594 Phalloidin室温孵育1 h 后PBS 洗涤3 次，加入PBS 稀释的Hoechst 33342 后荧光显微镜拍照，Image J 软件统计各组穿过CollagenI的细胞数。

1.2.8 Annexin V-AlexaFluor647/PI双染法流式检测细胞凋亡取对数生长期的U87、CF5 和G11 细胞，以1×105/孔接种于6 孔板，每组设3 个复孔，24 h后更换培养基为无血清DMEM同时加入阿霉素诱导细胞凋亡，继续培24h。按细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，流式细胞仪上机检测细胞凋亡率。

1.2.9 细胞转录组测序和数据分析按RNA 提取试剂盒（QIAGEN 公司）方法提取细胞RNA，选择纯度较好（紫外260OD/280OD 为1.8-2.1）的样本进行RNA 变性胶电泳质检，样本-80 ℃保存备用。建库后，使用HiSeq 3000（Illumina 公司）测序仪进行上机检测，CASAVA v1.8.2 软件将原始测序数据（Bcl 文件）转换成fastq 格式以备用，使用FastQC v0.11.2 软件对测序数据进行序列比对前的初始质量检查，并以人类基因组和转录组数据库（GRCh37）为参考库，综合使用TopHat2、bowtie 软件包对序列进行比对拼接产生数据（bam 文件），用bedtools v2.22.1和python脚本程序等将bam 文件进行格式转化、并以mRNA表达值差异2倍以上的标准进行差异基因筛选和数据分析。数据分析包括：基因表达定量、表达分布、差异表达分析、KEGG和GO功能通路富集分析等。

1.2.10 RT-PCR 检测细胞中ITGA6、ITGA11 的表达水平TRIzol法提取U87、CF5和G11细胞的总RNA并检测其纯度及浓度。取2µg总RNA，反转录成cDNA；取2µL cDNA 为模板进行PCR 扩增，每个样品设3 个复孔，反应条件为：95 ℃预变性5 min、95 ℃变性30 s、60 ℃退火10 s、72 ℃延伸15 s，共40次循环。引物序列分别为：ITGA6 上游：5′-CGAAACCAAGGTTCTGAGCCCA-3′，下游：5′-CTTGGATCTCCACTGAGGCAGT-3′；ITGA11 上游：5′-GCCTCCAGTATTTTGGCTGCAG-3′，下游：5′-GCTCAAAGTGGAGGCTGGCATT-3′；内参引物GAPDH上游：5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′；下游：5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′。采用2-△△Ct法计算ITGA6和ITGA11mRNA的相对表达水平。

1.3 统计学分析采用SPSS 20.0 和Graphpadprism 6.0 软件进行数据分析，定量资料以均数±标准差（xˉ±s）表示。多个样本组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 法。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 U87 单克隆细胞株的筛选构建可见混合型U87形态多样，大小不一，而经单克隆化后细胞株形态较为均一，其中CF5小而短粗，G11大而细长。见图1。STR 分型鉴定显示，3 株细胞与美国模式培养物研究所中参考细胞系匹配率均为86.67%，因此可认为本研究使用的U87 以及2 株单克隆细胞CF5 和G11均来源于人胶质母细胞瘤细胞系U87。

2.2 U87、CF5 和G11 细胞株的增殖能力、平板克隆和干细胞成球能力比较CCK-8增殖实验结果显示，U87、CF5 和G11 细胞在不同时间点增殖能力差异明显（P＜0.05）。CF5细胞增殖能力较U87、G11明显增强，U87较G11明显增强（P＜0.001），见表1。

EdU 掺入成像法增殖实验结果显示，CF5 细胞EdU 阳性细胞比例（0.54±0.05）较U87、G11（0.44±0.03）、（0.35±0.03）明显增强，U87 较G11 明显增强（P＜0.01），见图2。

图1 明场和荧光视野下的3株细胞形态（×200）Figure 1 Morphology of the three cell lines under the phase-contrast and fluorescence microscope（×200）

表1 CCK-8检测不同时间各组细胞相对增殖率比较（xˉ±s）Table 1 Relative proliferation of the three cell lines at different time points（xˉ±s）

平板克隆形成实验显示，CF5 细胞克隆形成能力［（88.33±3.06）个］较U87、G11［（53.67±3.06）、（42.00±3.00）个］明显增强，U87较G11明显增强（P＜0.01），见图2。

肿瘤干细胞成球实验显示，CF5 细胞干细胞球的直径［（281.8±83.83）µm］较U87、G11［（241.6±66.48）µm、（176.9±47.09）µm］明显增强，U87 较G11明显增强（P＜0.01），见图2。

图2 3株细胞的增殖能力、克隆形成和干细胞成球能力Figure 2 Proliferation，colony formation and tumor sphere formation of the glioblatoma U87 monoclonal cells

2.3 U87、CF5 和G11 细胞株粘附和侵袭能力的比较黏附1 h后，U87、CF5和G11平均黏附面积分别为（1459±164.1）µm2、（878.2±55.96）µm2和（2168±438.8）µm2，G11 黏 附 面 积 最 大，CF5 最 小（P＜0.001），见图3。

CCK-8 法黏附实验结果显示，黏附1 h 后，U87、CF5 和G11 细胞平均相对黏附率分别为（1.00±0.08）、（0.81±0.03）和（1.14±0.01），G11 黏附率能力最强，U87次之，CF5最弱（P＜0.001）。

3D 培养侵袭实验结果显示，U87、CF5 和G11 细胞72h内从基质胶接口处迁移到基质胶内细胞数量分别为（73.31±5.43）个、（34.01±4.55）个和（179.8±26.14）个，G11 细胞侵袭能力最强，CF5 最弱（P＜0.05），见图4。

图3 免疫荧光法检测细胞平均黏附面积（×200）Figure 3 Immunofluorescence images of the adhesion areas of the three cell lines（×200）

图4 3D培养侵袭实验检测细胞侵袭能力（×100）Figure 4 3D culture images of the invasion ability of the three cell lines（×100）

图5 流式细胞术检测3株细胞凋亡能力Figure 5 Apoptosis of the three cell lines detected by flow cytometry

2.4 U87、CF5 和G11 细胞株对药物诱导凋亡敏感性的比较Doxorubicin 的促凋亡反应，U87、CF5 和G11 3 组细胞凋亡率分别为（8.75±0.09）%、（4.98±0.83）%和（11.23±0.80）%，CF5 耐受性最强，G11 最弱，差异有统计学意义（P＜0.01），见图5。2.5 U87、CF5 和G11 细胞基因调控通路差异转录组测序结果显示，3 株细胞在基因表达层面存在较大差异，见图6。交互分析发现CF5 相对G11 和U87 均下调的基因有159 个，均上调的基因有303个；G11 相对CF5 和U87 均下调的基因有281 个，上调的基因则有116 个；通路富集分析显示CF5 和G11 在细胞外基质相关的通路有最高的富集度，而细胞外基质相关通路与肿瘤侵袭、耐药等功能表型密切相关。因此，挑选了其中代表性的同一家族差异基因ITGA6和ITGA11进行PCR验证。

荧光定量PCR 结果显示，G11 ITGA6 相对表达量（1.62±0.10）较U87、CF5（1.01±0.16、0.08±0.01）明显增高，U87 较CF5 明显增高（P＜0.05）。CF5 ITGA11 表 达 量（3.10±0.58）较U87、CF5（1.00±0.11、0.10±0.02）明 显 增 高，U87 较CF5 明 显 增 高（P＜0.05）。荧光定量PCR结果与测序结果一致。

图6 3株细胞差异基因表达情况Figure 6 Differential gene expressions in the three cell lines determined by qRT-PCR

3 讨 论

肿瘤异质性是恶性肿瘤的特征之一，肿瘤在生长过程中，经过多次分裂增殖，其子细胞呈现出分子生物学或基因方面的改变，从而使不同克隆亚群在生长速度、侵袭能力、药物敏感性、预后等方面产生差异［14-15］。而肿瘤干细胞克隆选择性、基因组不稳定性和进化差异是导致肿瘤异质性的重要原因［16-17］。在肿瘤研究中，细胞离体实验是必不可少的，来源更单一的细胞系，受体外培养条件和传代次数的影响，细胞间也存在较大差异［18-19］。细胞间特定基因或分子功能簇的差异会导致一些功能基因的过表达或敲减/敲除达不到所对应的功能表型。因此，从混合细胞或细胞株中依据特定标志物、形态和功能差异挑选单一细胞，扩增并构建细胞株，并从基因学背景寻找不同单克隆细胞株异质性差异，对后续挑选合适的细胞进行分子和药物研究具有指导意义。

本研究构建了多个U87 的单克隆细胞株，这些细胞在形态、功能表型上存在较大差异。结果显示，CF5 细胞株具有典型的短梭形形态特征，其增殖、干细胞成球和抗凋亡能力最强；而G11呈细长形态，其黏附和侵袭能力最强，增殖、干细胞成球和抗凋亡能力却较弱。转录组测序及生物信息分析显示，即使在全程平行培养条件下，这些细胞间也存在大量差异表达基因。富集分析展示了差异表达基因所影响的通路和功能的差异。CF5 和G11 下调基因在细胞外基质相关通路上均有最高富集度，而细胞外基质相关通路与恶性肿瘤功能表型和预后密切相关，比如整合素家族基因ITGA6、ITGA11 及赖氨酰氧化酶等，在肿瘤侵袭和上皮间质转换中发挥重要作用［20-22］。另外即使CF5 和G11 下调基因在细胞外基质相关通路上均有最高富集度，但是所富集到的基因完全不同，提示这2 株细胞在生物学表型上的差异由不同的基因或基因集所驱动。另外，PCR 结果显示，上述提到的基因在3 株细胞中的表达具有显著差异，因此在研究基因功能时宜根据基因表达差异对所选细胞进行针对性的过表达/敲减、敲除等操作，而不宜用混合型细胞。通过本研究，我们认为造成相同培养环境下单克隆细胞株功能表型的差异来源于细胞间基因背景的差异，而这些基因表达差异的来源则需要更深入的研究。同时，这些结果也提示我们在研究基因、蛋白等分子在肿瘤细胞中功能表型及机制时，需明确这些分子在所选细胞中的表达情况。

综上所述，本研究筛选建立的单克隆细胞株为GBM 功能学实验构建了一个有用的细胞模型，同时筛选出的单克隆细胞株转录组测序信息也为后续胶质母细胞瘤肿瘤异质性机制的研究奠定了基础。