恒定亚低温对猪体外心肺复苏后的肾保护作用

尤 勇，张北源，陈显成，钱雅君，陈 鸣，虞竹溪，虞文魁

0 引 言

心搏骤停后39.8%～43%的患者存在急性肾损伤，心搏骤停后急性肾损伤的发生与高病死率密切相关［1-2］，保护心搏骤停后肾功能显得尤为重要。亚低温治疗是心脏骤停后脑保护的重要措施，也是研究者关注的热点。然而，亚低温对于心肺复苏后肾功能的保护作用和机制仍是不确定的［3］。目前关于亚低温对心搏骤停后肾保护作用的研究甚少，少量的文献报道亚低温可能减少肾缺血损伤，对肾功能有保护作用，但存在争议［4-5］。我们设计了这个动物实验，首先在于观察亚低温对心肺复苏后猪肾的保护作用，并探索其中机制。在亚低温维持阶段的24～48 h里，由于临床医师采取的降温措施的局限性（特别是采取药物降温和体表降温方法的患者），以及临床关注度和细节处理的差异，实际上患者往往难以保持相对稳定的目标体温，在亚低温维持阶段患者体温大幅波动比较常见，这是否会影响亚低温治疗效果，目前尚未可知。文献报道，在亚低温治疗结束后，过快复温带来的温度波动导致炎症反应放大，对机体器官带来严重的二次损伤［6］，可能会因此削弱亚低温治疗的器官保护效果。我们推测，在亚低温维持阶段，异常的体温波动同样会影响亚低温的治疗效果。故本研究还旨在比较波动亚低温和恒定亚低温对心肺复苏后猪肾的保护作用是否存在差异。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组健康实验用猪18 只，由南京大学医学院附属鼓楼医院动物实验中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2014-0051，体重50～55 kg。采用随机数字表法将其分为3 组：恒温组、变温组和对照组，每组6只。

1.2 麻醉与监护实验前禁食24 h，不禁水。开放耳缘静脉，采用氯胺酮20 mg/kg注射进行诱导麻醉，丙泊酚4～6 mg/（kg·h）、芬太尼2 µg/（kg·h）持续泵入维持麻醉。经口气管插管接呼吸机（Evita XL，Drager，德国）辅助呼吸，模式为容量控制同步间歇指令通气（V-SIMV），参数：FiO250%，Vt 8 mL/kg，PEEP 5 cmH2O（1 cmH20=0.098 kPa），I∶E=1∶1.5，心率15 次/min。连接心电监护仪，舌尖监测外周血氧饱和度。床旁超声引导下于左侧股动脉置入PICCO动脉测压导管（4F，PV2014L16，Pulsion Medical System，德国），实时监测动脉血压及血温，左颈内静脉置入双腔深静脉导管（7F，CVC-2，FORNIA，中国）用于补液及给药。复方氯化钠注射液、5%葡萄糖氯化钠注射液10～15 mL/（kg·h）交替持续静脉补液。

1.3 体外膜肺氧合(extracorporeal membrane oxygenation,ECMO)准备 ECMO 管路预充：0.9%等渗盐水注射液充分排气，羟乙基淀粉200/0.5 氯化钠注射液500 mL预充管路，预充液中加入肝素钠注射液25 mg。ECMO 导管置入：实验动物颈部及腹股沟备皮，充分消毒，床旁超声定位穿刺血管，经皮穿刺，放置导丝，沿导丝逐级扩张，分别放置14 Fr颈内静脉，8 Fr股动脉插管，经超声定位证实导管分别达到右房、髂动脉处，管道钳夹闭，静脉推注1mg/kg肝素钠注射液预抗凝，丝线缝扎固定。

1.4 心跳骤停模型建立与体外心肺复苏（extracorporeal ardiopulmonary resuscitation,ECPR）停止机械通气，经胸壁以36 V 交流电进行电击，持续时间30 s，必要时重复，直至ECG 呈室颤波形，ABP波形消失，数值为0，持续8 min 后开始进行心肺复苏，持续胸外按压，并实施非同步直流电击除颤（150～200 J），恢复机械通气（FiO2100%，余参数同前）。胸外按压频率至少100 次/min，按压深度为胸廓前后径1/3，期间间断给予肾上腺素、碳酸氢钠及阿托品，直至心搏恢复，重新建立循环。心肺复苏开始后，将实验动物动静脉管路分别连接预充好的ECMO 管路，ECMO 转速调整为2000～2500 转/min，流量控制为20～40 mL/（kg·min），氧流量调整为1.0～1.5 mL/min。应用去甲肾上腺素维持平均动脉压＞65 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），并适当补充复方氯化钠、羟乙基淀粉及调整电解质、酸碱平衡。在ECMO 运转过程中持续静脉泵入肝素钠抗凝，根据ACT及有无出血倾向调整肝素速率。

1.5 体温管理恒温组将ECMO 水浴箱温度调整至34℃，变温组则每2小时调节水浴箱温度，让动物体温波动于33～35 ℃。对照组将ECMO 水浴箱温度调整至37℃。恒温组和的变温组动物维持亚低温治疗24 h 后予以复温，复温速度控制在每2 小时升高≤1℃，直至血温达37 ℃。

1.6 标本收集与观察方法复温结束后，全麻下打开腹腔切取右肾，取右肾皮髓交界处数小块标本，分别置于10%福尔马林和液氮冻存管保存。实验结束后按伦理规定处死动物。

1.6.1 实时荧光定量PCR测定凋亡基因BAX、Bcl-2、GRP78、CHOP蛋白的表达。肾组织mRNA的提取和逆转录均按照说明书进行。实时荧光定量PCR反应体系为2×qPCR Mix12.5 µL、7.5 µmol/L 基因引物2.0µL、反转录产物2.5µL、ddH2O 8.0µL。PCR扩增：预变性95 ℃10 min；变性95 ℃15 s，60℃退火60 s，循环40次；熔解曲线60→95 ℃，每15 s升温0.3 ℃。结果处理ΔΔCT法，目的基因相对表达量=2-ΔΔCT。

ΔΔCT=［CT（目的基因，待测样本）-CT（内标基因，待测样本）］-［CT（目的基因，对照样本）-CT（内标基因，对照样本）］

引物序列：Bax：上游5′-GGTTTCATCCAGGATCGAGCAG-3′，下 游 上 游5′-TGCCGTCAGCAAACATTTCG-3′；Bcl-2：上 游5′-TGTGGCCTTCTTTGAGTTCGG-3′，下 游 上 游5′-CCATACAGCTCCACAAAGGCAT-3′；GRP78：上 游 5′-GTTCCTGCCTTTCAAGGTGGTT-3′， 下 游 上 游 5′-TTCCCAAATAAGCCTCAGCAGTT-3′；CHOP：上 游5′-AGTCATTGCCTTTCTCCTTCGG-3′，下游上游5′-GGTCTTCTTTGGTCTTCCTCCTCT-3′；Gapdh：上 游5′-GTGAAGGTCGGAGTGAACGGA-3′，下游上游5′-CCATTTGATGTTGGCGGGAT-3′。

1.6.2 免疫组织化学检测将石蜡切片进行脱蜡水化，置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液（pH 6.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，放入3%双氧水溶液中室温避光孵育25 min，将玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。在组化圈内滴加3%BSA 均匀覆盖组织，室温封闭30 min。加入一抗4 ℃过夜，自然恢复至室温，再加入二抗，室温孵育50 min。滴加新鲜配制的DAB 显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。苏木精复染3 min 左右，自来水洗，苏木精分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木精返蓝液返蓝，流水冲洗，脱水封固。显微镜镜检，图像采集分析。结果判定：苏木精染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色。

1.6.3 组织病理学检查取猪肾组织置于2.5%戊二醛溶液中固定24 h，经漂洗、再固定、脱水、环氧树脂包埋、超薄切片后装上铜载网格，行铅铀双染，置于透射电镜下观察超微结构并拍照。

1.7 统计学分析应用SPSS 22. 0 软件进行统计分析。定量资料以均数±标准差（xˉ±s）表示，进行正态性检验，如果资料符合正态分布，则选用方差分析，如果不服从正态分布，采用秩和检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 动物模型制作18 只实验用猪均制作成电击后心跳骤停模型，并全部成功实施体外心肺复苏术，复苏成功率100%。平均复苏时间为（6.3±2.9）min，3组间复苏时间差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 实时定量PCR 结果与常温组比较，变温组、恒温组中肾组织中GRP78、CHOP 表达均降低、Bcl-2 表达升高（P＜0.05），恒温组Bax 表达降低（P＜0.05）；与变温组比较，恒温组Bcl-2表达升高，GRP78表达降低（P＜0.05）。见表1。

表1 RT-PCR 检测凋亡相关基因荧光实时PCR 表达倍数（±s）Table 1 The expression of apoptosis related genes after quantitative RT-PCR（xˉ±s）

表1 RT-PCR 检测凋亡相关基因荧光实时PCR 表达倍数（±s）Table 1 The expression of apoptosis related genes after quantitative RT-PCR（xˉ±s）

与常温组比较，*P＜0.05，与变温组比较，#P＜0.05

组别常温组变温组恒温组n666 Bax 2.00±0.57 1.79±0.60 1.05±0.29*Bcl-2 1.03±0.20 1.65±0.34*2.42±0.64*#GRP78 0.59±0.11 0.42±0.14*0.22±0.08*#CHOP 2.51±0.42 1.84±0.49*1.30±0.59*

2.3 免疫组化结果光镜下观察免疫组织化学切片，结果显示：常温组猪肾组织Bax 呈强阳性表达，变温组Bax 阳性表达减弱，恒温组仅少量Bax 呈弱阳性表达；恒温组Bcl-2 阳性表达最为显著，Bcl-2 阳性表达在常温组最少。见图1。

2.4 透射电子显微镜常温组猪肾表现为核膜皱缩，核仁缩小，细胞核内染色质高度盘绕，细胞质中可见线粒体明显肿胀，脊结构消失，产生空泡样改变。变温组较常温组损伤程度减轻，部分肾小管上皮细胞出现核膜皱缩，核染色质浓聚致密，染色质边集成环形，出现许多空泡结构。恒温组损伤程度最轻，多数细胞形态学变化不明显，细胞核位于细胞中部，核膜形态完整，染色质分布较均匀，细胞质内见正常线粒体等细胞器。见图2。

图1 镜下观察猪肾组织Bax、Bcl-2细胞形态（免疫组化染色×200）Figure 1 Immunohistochemical DAB staining of Bcl-2 in swine renal tissue（IHC×200）

图2 猪右肾皮髓交界处组织电镜观察结果（×3000）Figure 2 The results of the transmission electron microscopy of the right renal cortex medullary junction in swines（×3000）

3 讨 论

一直以来，心跳骤停大动物模型面临着复苏成功率低、复苏后并发症多、个体原发性损伤差异大等困难，导致研究基线难以匹配一致，研究结论备受争议。本研究采用了体外心肺复苏的方式，在开始常规心肺复苏的同时，运行体外膜肺支持，大大提高了动物模型心肺复苏的成功率［7］，最大限度地降低复苏后血流动力学紊乱的个体差异，减轻研究结果偏移。另外，体外膜肺的控温系统用于亚低温治疗期间的体温管理，易于监控和调节，能够达到可靠稳定的降温目标。这一动物模型的缺陷在于高成本和高技术要求。

心搏骤停在经过成功的心肺复苏后恢复自主循环，机体各重要器官在经过长时间、完全的缺血之后面临缺血-再灌注损伤的二次打击，包括钙超载、炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等多种机制参与肾缺血-再灌注损伤的病理生理过程［3］。研究发现，肾缺血-再灌注过程中，肾皮髓质交界区肾小管细胞发生凋亡，72h后出现特征性凋亡小体［8］。目前观点认为肾小管细胞凋亡是缺血再灌注损伤的重要环节之一，是导致缺血再灌注后肾功能障碍的重要因素［10］。亚低温是心肺复苏后神经保护的重要治疗措施，近年来，亚低温对组织缺血缺氧的保护作用越来越受到学者们的关注，其对凋亡信号通路的抑制是亚低温神经保护作用的机制之一［10］，研究发现亚低温可以降低促凋亡蛋白Bax 的表达，明显减少缺血再灌注后凋亡神经元数量［11］。但是亚低温对于缺血再灌注后肾的作用目前知之甚少。有小样本临床研究显示，亚低温可能通过降低代谢和氧耗保护心肺复苏后肾功能［6］，但存在很多争议［12-13］。本研究通过观察ECPR 后猪肾组织形态学，发现亚低温（包括恒定亚低温和波动亚低温）能够显著减轻肾缺血再灌注损伤，减少肾组织内凋亡细胞数量，结合ECPR 后猪肾组织中调控细胞凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、GRP-78、CHOP）表达情况，认为亚低温可以减轻心肺复苏后肾损伤，可能与其降低缺血再灌注所致的内质网应激，从而下调肾小管细胞凋亡有关。

目前临床有多种措施用于诱导和维持亚低温，常用的降温措施包括药物降温、体表降温和核心降温。药物降温通常选择肌松药联合冬眠合剂，可配合静脉输注冷盐水。体表降温包含擦浴、外部水循环降温毯、凝胶涂层降温毯等，核心降温主要是血管内球囊冷却系统、各体腔（腹腔、胸腔、胃肠道等）灌注等。目前临床上常用的各种降温措施在亚低温诱导阶段的作用基本可靠，但在维持阶段对体温的控制均不稳定［14］，可能会导致体温波动不定，而且难以调整，这在临床上十分常见。已有研究表明在复温阶段，体温上升速度需要严格控制，否则影响亚低温对器官功能的保护作用，甚至可能损伤肾功能［6］，说明体温波动对患者影响之大。但是在亚低温维持阶段，温度的波动会对器官功能造成什么影响，目前尚无报道。本研究在亚低温维持阶段，模拟临床上体温控制不稳定的现象设置变温组，每2小时调节水浴箱温度，让动物模型体温波动于33～35 ℃之间。研究结果揭示，变温组动物模型肾小管细胞凋亡程度较恒温组严重，亚低温维持阶段的异常体温波动通过调节内质网应激诱导的细胞凋亡途径影响亚低温治疗效果。目前尚无研究报道在亚低温维持阶段体温的异常波动对脏器功能造成何种影响，本实验结果首次揭示，亚低温维持阶段体温的异常波动造成肾小管细胞凋亡增加，削弱了亚低温对猪肾的保护作用，维持恒定亚低温对于保护心肺复苏后肾功能非常重要。

综上所述，恒定亚低温通过抑制心肺复苏后猪肾小管细胞内质网应激，减轻肾小管细胞凋亡，起到肾保护作用；亚低温维持阶段的体温异常波动可能削弱亚低温对肾的保护作用。