高压脉冲电场技术在实验教学中的应用

张 燕， 赵颂宁， 赫桂丹， 刘博群， 刘静波

(吉林大学 食品科学与工程学院， 长春 130062)

0 引 言

高压脉冲电场技术(High Intensity Pulsed Electric Fields, PEF)是高电压工程和脉冲功率技术的结合，是最具有工业化应用前景的非热加工技术之一[1]。由于其低能耗、处理快速、且能避免或极大地降低食品在处理过程中的感官品质和物理特性的变化，很大程度地保持食品的原有品质，在食品工程和生物学领域应用广泛[2-4]。

在我校功能性食品实验教学中，开放性、设计性综合实验教学是其特色，实验的选题为实际样品中功能成分的提取、分析检测及功能学评价等。如“植物功能因子的提取技术”就是以“浆果之王”蓝莓为原料，因其中含有大量的酚类和花青素类物质，能有效清除体内自由基，具有很高的抗氧化活性[5-8]。传统实验对蓝莓中花青素、多酚等功效成分的提取多采用热回流法，加热处理会造成花青素和多酚物质的降解破坏，有效成分含量下降[9-12]。本文建立的高压脉冲电场法提取蓝莓中多酚类物质，采用响应面分析法对提取工艺进行了优化，增加了教学实验的开放性与设计性，有利于学生创新性思维的开发、教学质量的提高。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

PEF装置(频率1～3 kHz；处理液流速0～100 mL/min；处理室直径1 mm;脉宽为1 μs)；

电子天平，BT25S，瑞士梅特勒-托利多公司；

紫外分光光度计，UV2550，日本岛津公司；

干燥箱，PH-070A，上海一恒科学仪器有限公司。

冷冻蓝莓果，由吉林大学提供；氢化锦葵色素-3-B-葡糖苷，Sigma公司；无水乙醇、浓盐酸、碳酸钠、福林酚试剂，均购自北京化工厂。

1.2 单因素实验设计

称取蓝莓，磨浆，加入乙醇，调节pH值，均质，高压脉冲电场作用，放置12 h，过滤，取上清液，测定吸光度值。以总酚得率为评价指标，考察料液比、乙醇浓度、pH值、电场场强、脉冲数对总酚得率的影响，单因素设计与水平见表1。

表1 单因素设计与水平

1.3 响应面实验方案设计

根据单因素试验结果，利用Design-Expert 8.0.5软件中的 Box-Behnken中心组合试验设计原理，以多酚类化合物含量为响应值，通过响应面分析进行提取条件的优化，各因子编码与取值水平见表2。

1.4 标准曲线的绘制

准确称取20 mg没食子酸标准品，用去离子水配制成浓度为0.1 mg/mL的没食子酸标准溶液。精确量取上述标准液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL于50 mL容量瓶中，加入30 mL水，摇匀，再加入2.5 mL福林酚(FC)试剂，摇匀。0.5～8 min内加入

表2 响应面实验因素与水平

7.5 mL碳酸钠溶液(20%)，混匀定容至刻度。避光，室温静置1 h，在750 nm处测定吸光度值，并建立标准曲线。

2 实验结果及分析

2.1 标准曲线的建立

以没食子酸标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，制得标准曲线如图1所示，回归方程为y=1.97x+0.021 1，R2=0.999 9。

图1 总酚标准曲线图

2.2 单因素试验结果及分析

(1) 料液比的影响。在pH 2，电场场强45 kV/cm，乙醇浓度60%，脉冲数6的条件下，料液比分别选择10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、1∶60，高压脉冲电场作用后室温浸提12 h，过滤，测定吸光度值，结果如图2所示。

图2 料液比对总酚得率的影响

从图2中可以看出，料液比在30∶1～50∶1之间时，总酚得率较高，其中在40∶1时得率达到31.10%。当料液比大于50∶1时，总酚得率略微降低。

(2) 乙醇浓度的影响。在pH2，电场场强45 kV/cm，料液比30∶1，脉冲数6的条件下，乙醇浓度分别选择0%、20%、40%、60%、80%、100%，高压脉冲电场作用后室温浸提12 h，过滤，测定吸光度值，结果如图3所示。

图3 乙醇浓度对总酚得率的影响

从图3中可以看出，乙醇浓度在60%～80%之间时，总酚得率较高，其中在80%时得率达到33.46%。当乙醇浓度较高或较低时，总酚得率降低。

(3) pH值的影响。在乙醇浓度60%，脉冲数6，料液比30∶1，电场场强45 kV/cm的条件下， pH分别选择1～6，高压脉冲电场作用后室温浸提12 h，过滤，测定吸光度值，结果如图4所示。

图4 pH值对总酚得率的影响

从图4中可以看出，pH值在2～4之间时，总酚得率较高，其中在pH3时得率达到31.00%。

(4) 电场场强的影响。在料液比30∶1，乙醇浓度60%，pH 2，脉冲数6的条件下，电场场强分别选择15、30、45、60、70 kV/cm，高压脉冲电场作用后室温浸提12 h，过滤，测定吸光度值，考察电场场强对其的影响。结果如图5所示。

图5 电场场强对总酚得率的影响

从图5中可以看出，电场场强在30～60 kV/cm之间时，总酚得率较高，其中在45 kV/cm时得率达到30.31%。当电场场强达到60、70 kV/cm，总酚得率明显降低。

(5) 脉冲数的影响。在料液比30∶1，乙醇浓度60%，pH=2，电场场强45 kV/cm的条件下，脉冲数分别选择2、4、6、8、10，高压脉冲电场作用后室温浸提12 h，过滤，测定吸光度值，结果如图6所示。

图6 脉冲数对总酚得率的影响

从图6中可以看出，脉冲数在4～8之间时，总酚得率较高，其中在6时得率达到31.38%。

2.3 响应面法优化多酚类化合物提取条件实验结果

(1) 实验设计及结果。通过单因素实验，确定pH值在2～4、料液比在30∶1～50∶1、乙醇浓度在60%～80%，电场场强在30～60 kV/cm，脉冲数在4～8时，总酚得率较高。为进一步优化蓝莓总酚提取条件，以总酚得率为响应值，应用Design-Expert 8.0.5b软件中Box-Behnken 试验设计原理设计响应面实验，实验结果见表3。由表3可见，第36个处理组总酚的得率最高，即在料液比40∶1、乙醇浓度75%、pH 3、电场场强45 kV/cm、脉冲数6的处理条件下，总酚得率可达到36.88%。

(2) 回归模型的建立及方差分析。对响应面实验结果进行回归分析，建立多项式回归模型，得到各因子编码值的回归方程

总酚得率=34.55-2.76A-1.46B-3.29C-

2.82D+1.19E+4.93AB+2.05AC+

0.87AD+0.94AE+1.14BC+1.00BD-

0.16BE-1.01CD-1.30CE-1.36DE-

4.92A2-7.76B2-8.06C2-5.96D2-7.09E2

对总酚得率的二次回归方程进行显著性检验及方差分析，结果见表4。表4结果显示，该模型(P<0.000 1)，具有高度显著性，表明模型成立。模型失拟项P=0.199 3>0.1，不显著，说明模型预测值和真实情况间无显著性差异，模型拟合度较好。在回归模型中一次项A、B、C、D、E，交互项AB，二次项A2、B2、C2、D2、E2均表现出显著水平。通过F值的比较，得出该模型各因素对响应值总酚得率影响的显著性大小为pH值>料液比>电场场强>乙醇浓度>脉冲数。

(3) 总酚得率响应面分析图。各因素之间两两交互作用分析等值线和曲面如图7所示。由图7中曲面图可以看出，各图均呈开口向下，凸形的曲面，具有极值。等高线图中由图7(a)可以看出，料液比(A)和乙醇浓度(B)等高线图呈椭圆形，说明两者之间交互作用极显著，随着料液比和乙醇浓度不断增大，多酚得率呈现先增大后减小的趋势。其他几个因素两两间交互作用等高线图呈圆形，说明交互作用不显著，在实验范围内随着两者不断增大，总酚得率呈先增大后减小的趋势。当乙醇浓度固定不变时，总酚得率随料液比、pH值、电场场强和脉冲数的增加而先增加后降低，可能是因为高压脉冲电场处理过的液体颗粒度降低，增大颗粒与溶剂的接触面积，得率增大。但当电场场强和脉冲数过大时，总酚得率迅速下降，可能因为破坏了总酚的结构从而影响了得率[14-15]。当电场场强和脉冲数固定不变时，乙醇浓度增加，总酚得率先增加后降低。

表3 响应面实验结果

表4 二次回归方程方差分析

注：**表示该水平极其显著(P<0.01)；*表示该水平显著(P<0.05)

通过响应面分析法对实验数据进行优化后，可以得出蓝莓多酚类化合物提取的最佳工艺参数为：料液比34.99∶1、乙醇浓度70.60%、pH值2.72、电场场强

(a) 料液比和乙醇浓度对总酚得率的影响

(b) 料液比和pH值对总酚得率的影响

(c) 料液比和电场场强对总酚得率的影响

(d) 料液比和脉冲数对总酚得率的影响

(e) 乙醇浓度和pH值对总酚得率的影响

(f) 乙醇浓度和电场场强对总酚得率的影响

(g) 乙醇浓度和脉冲数对总酚得率的影响

(h) pH值和电场场强对总酚得率的影响

(i) pH值和脉冲数对总酚得率的影响

(j) 电场场强和脉冲数对总酚得率的影响

图7 响应面分析图

40.70 kV/cm、脉冲数6.22，预测总酚的得率为36.381 6%。为了验证实验结果与实际情况是否一致，进一步做了验证实验，考虑到实验的方便性，将各因素数值进行取整后最佳工艺参数为：料液比35∶1、乙醇浓度70%、pH值2.7、电场场强40 kV/cm、脉冲数6，所得总酚得率为36.4%，与预测值的差异小于0.05%。因此，利用响应面法对高压脉冲电场提取蓝莓中酚类化合物的条件是可行的，得到的多酚类化合物的提取方法具有实际应用价值，为实验操作提供技术参考。

3 结 语

本实验将学生在食品专业基础课中学到的功能因子高效分离技术理论知识，结合现代高新提取技术，应用到功能性食品教学实验中。即将高压脉冲电场技术应用于功能性食品植物有效成分提取实验中，在老师的指导下，学生自主设计实验方案，运用单因素及响应面分析法设计实验，和传统教学实验“冷浸法提取蓝莓中酚类化合物”相比，本研究将现代大型仪器与实验教学相结合，不仅提高了蓝莓中多酚类化合物得率，采用不同的提取手段实现设计意图，还增加了教学实验的开放性和研究性，有利于丰富食品科学专业本科实验教学手段，有利于现代分离提取仪器在食品科学专业实验教学中的应用，有利于提高学生运用新技术分析、解决复杂工程问题的能力[16-17]。因此，这一成果的应用对于实验教学内容的丰富及教学质量的提高都有积极的影响。