口腔黏膜良性淋巴组织增生病中肥大细胞与微血管的相关性研究

张 昊 敦铃霞 谢以婷 李荷香 宋 鹏 刘慧娟 侯亚丽

口腔黏膜良性淋巴组织增生病（benign lymphoadenosis of oral mucosa，BLOM）是一种慢性炎症性口腔黏膜病，但由于其误诊率高，其病因和发病机制至今不甚清楚，治疗效果不佳。因此，探讨其发病机制，寻找新的治疗靶点势在必行。目前，越来越多的证据[1]表明肥大细胞（mast cell，MC）对炎症性疾病的发病机制至关重要。而血管生成现象又是慢性炎症过程发病机制的基础。那么BLOM 中肥大细胞密度（mast cell density，MCD）和微血管密度（microvessel density，MVD）的关系如何？目前国内鲜有报道。因此，本研究采用免疫组织化学方法检测BLOM 中MCD 和MVD，探讨其相关性，为研究BLOM 发病机制，寻找新的治疗靶点提供线索。

资料和方法

一、材料

1.研究对象：30 例BLOM 蜡块均来自河北医科大学口腔医院病理科作为BLOM 组。15 例正常黏膜组织取自肿瘤周围正常黏膜作为正常对照组。30 例BLOM 患者均无移植物抗宿主疾病、丙型肝炎或艾滋病毒感染；活检前近六个月均没有接受过局部或全身治疗。

2.试剂：肥大细胞类胰蛋白酶单克隆抗体购自英国Abcam 公司、CD105 单克隆抗体、PV-9000 免疫组化试剂盒、DAB 显色试剂盒购自北京中杉金桥。

二、实验方法

1.免疫组织化学染色法：将BLOM 组和正常对照组蜡块分别切成厚度为3～4 微米的切片，常规脱蜡至水，0.01MPBS 冲洗5min×3 次，放入枸橼酸缓冲液中热修复，一抗类胰蛋白酶抗体滴度为1:1000，CD105 抗体滴度为1:100，以后按PV9000 试剂盒说明书操作，苏木素复染，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阳性对照采用已知的阳性组织切片，阴性对照用PBS 代替一抗。

2.MCD 和MVD 计数：分别将BLOM 组和正常对照组每张切片在低倍镜（×40）下选取肥大细胞类胰蛋白酶和CD105 染色最密集的部位，高倍镜（×400）下计数。凡胞浆呈现棕黄色或黄褐色的为阳性肥大细胞。胞浆呈现棕黄色或棕褐色的单个血管内皮细胞或细胞簇（小于3～5 个血管内皮细胞），与邻近结缔组织界限明显者计为一个独立的微血管。每张切片计数3 个高倍视野下肥大细胞数量和微血管数目，取其均值，分别作为MCD 和MVD 值。MCD 和MVD 计数由2 名病理科医师采用双盲法完成。

三、统计学处理

采用SPSS17.0 对数据进行统计学分析。计量资料采用平均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05 有统计学意义。相关性分析采用Spearman 检验，以P＜0.05 为有统计学意义。

结果

1.一般情况：30 例BLOM 中，男性11 例（36.67%），平均年龄56.2727±16.10025 岁，女性19 例（63.33%），平均年龄，53.5789±10.93575 岁。病程0.5～240 个月不等。15 例正常黏膜组织取自肿瘤周围正常黏膜作为正常对照组。其中男性7 例（46.67%），平均年龄58.8571±10.33487 岁、女性8 例（53.33%），平均年龄56.3750±8.38259 岁。

表1 BLOM 组和正常对照组MCD 和MVD 的关系

2.结果（表1）。

BLOM 组和正常对照组均有类胰蛋白酶阳性的MC（图1～2），30 例BLOM 中MCD 范围21～195.67，均值55.0183±34.45887；正常对照组MCD 范围13～35.67，均值19.9554±5.29479。两组比较，差异有明显统计学意义（P＜0.05）。

图1 MC 在BLOM 组的表达（免疫组织化学染色 ×200）

图2 MC 在正常对照组的表达（免疫组织化学染色 ×200）

图3 CD105 在BLOM 的表达（免疫组织化学×200）

图4 CD105 在正常对照组的表达（免疫组织化学染色 ×200）

CD105 阳性MVD 在BLOM 组为阳性表达（图3），在正常对照组几乎为阴性（图4）。BLOM 中MVD范围9.33～29，均值19.8850±6.21789；正常对照组MVD 范围0～2，均值1.0000±0.80178。两组比较，差异有明显统计学意义（P＜0.05）。

Spearman 等级相关分析显示BLOM 组MCD 与MVD 呈正相关（r＝0.619，P＜0.01）。

讨论

BLOM 是一种临床并不少见的口腔黏膜病，但由于其复杂的临床表现和高误诊率，治疗效果不佳，易反复复发出现癌变。

MC 来源于骨髓造血干细胞，是一种结缔组织的主要效应细胞，在炎症过程中起着关键作用。研究已表明多种口腔炎症性疾病如口腔扁平苔藓[2]，牙周炎[3]，根尖周囊肿[3]中都发现有MC 浸润的增高。MC 胞浆中含有异染颗粒，其中类胰蛋白酶是含量最多的介质。BLOM 病理特征是在不同程度淋巴细胞、浆细胞和粒细胞浸润背景上有淋巴滤泡形成或淋巴细胞灶状聚集，这说明BLOM 是一种慢性炎症性口腔黏膜病。Scardina 等[4]认为血管生成现象是慢性炎症过程发病机制的基础。目前，大多数研究者常采用CD31、CD34 和血管内皮生长因子（VEGF）等广泛内皮细胞标记物检测MVD[5]。但是这些泛血管内皮细胞标志物对新生血管缺乏特异性，对组织中所有内皮细胞均有表达，而CD105 仅对活化的新生血管内皮细胞表达。因此，CD105 被研究者认为是一种新生血管的特异标记物[6，7]。本研究结果显示，BLOM 中MCD 较对正常照组明显升高，与平昭等研究结果相似。CD105 标记的MVD 在正常对照组阴性表达，在BLOM 组阳性表达，两组相比较，CD105-MVD 数目有显著性差异，这说明BLOM 中存在明显的血管生成现象，与李曙霞[8]等研究结果一致。Sheelam S[9]等认为血管生成会导致更多淋巴细胞的募集和保留，从而加重炎症，使疾病进展或病变复发，导致癌变。因此，靶向血管形成的各种分子和途径的治疗可以更好地控制潜在恶性疾病的进展。有研究[10]表明血管生成在口腔黏膜白斑恶性转变的早期阶段就已经开启。但是否也在BLOM 癌变的早期阶段开启了血管的生成，有待进一步研究。本研究结果还显示BLOM 组MCD 和MVD 存在正相关性，进一步说明了MC 参与了BLOM 中血管的新生，为寻找BLOM 新的治疗靶点提供了线索。BLOM 是某种刺激因素导致的淋巴组织的反应性增生性疾病。细菌、病毒或者某种刺激可能在一定条件下激活MC，使MC 脱颗粒，分泌肝素、组胺、血管内皮生长因子和类胰蛋白酶等多种促血管生成因子[3]诱导微血管内皮细胞增殖。MC 在脱颗粒的的同时，也可以合成并分泌TNF-α，而TNF-α 能够上调C-C 趋化因子受体1 型和RANTES 表达[11]，从而触发MC 进一步脱颗粒，释放促血管生成因子，引起白细胞迁移、加重炎症和导致血管新生。