长链非编码RNA meg3多态性与口腔鳞癌风险的相关性分析

JEONG YUNHO 赵志河

口腔鳞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）在口腔颌面部肿瘤中发病率中排首位，是头颈部位置中恶性肿瘤中较为常见的疾病之一[1，2]。目前OSCC发病原理尚待探讨，但已有文献报道，遗传易感性在OSCC 发展发挥主要作用[3，4]。既往文献指出，单核苷酸多态性（single uncleotidepilymorphism，SNPs）是至关重要的遗传因素；长链非编码RNA（long noncoding RNA，LncRNA）中涵盖200 多个核苷酸，是miRNA 样特征新非编码RNA 组家族中一员[5]。已验证IncRNA 中在母系表达基因3（maternally expressed gene3，MEG3）基因编码髓细胞在癌症诱导过程、肿瘤转移等方面均有参与，MEG3 可调节癌症细胞的活化与增殖分裂，健康人机体组织中同样含大量MEG3[6]。目前LncRNAMEG3 中SNPs 已大量报道与直肠癌、宫颈癌等发病风险机制密切相关，现阶段关于口腔鳞癌风险相关性分析报道较少。故本文重点探讨长链非编码RNA MEG 3 多态性与OSCC易感性的关系，分析与口腔鳞癌风险的相关性。

资料和方法

1.临床资料

选取2017 年2 月至2019 年2 月我院收治手术治疗与病理资料完整的口腔鳞癌患者98 例作为研究对象（实验组），选取同期到我院体检健康的群体86 例作为对照组，所有入选患者手术治疗前，均未进行过任何放疗或新辅助化疗；年龄18～65 岁；排除既往免疫缺陷、自身免疫疾病、肝炎、HIV 及其他已经感染性疾病者。98 例口腔鳞癌患者中唇鳞状细胞癌21 例，舌鳞状细胞癌48 例，颊黏膜鳞状细胞癌29 例；病理分级：I 级：24 例；Ⅱ级17；Ⅲ级31 例；Ⅳ级：26 例；TNM 分期参照UICC2002 口腔癌分期标准[7]：T1 期：41 例；T2 期：25 例；T3 期：20；T4 期12例；N0 期：45 例；N1-2 期：56 例。实验组与对照组在年龄、性别比较差异无统计学意义（P＞0.05）；但实验组中吸烟史、饮酒史明显高于对照组（P＜0.05）。见表1。本研究所有入选患者均为自愿参与本研究，且签署知情同意书，获得我院伦理委员会批准。

表1 两组基本资料比较

2.方法

收集所有研究对象的年龄、性别、吸烟史饮酒史等一般资料，将具有统计学意义的因素采用多元回归模型调整变量因素，然后进行IncRNA MEG3 基因多态性筛选，以dbSNP 数据库作为IncRNA MEG3 中SPNs 基因多态性筛查对照标准，并进行PCR 扩增及酶切观察SPNs 多态性基因位点变化。

DNA 提取与基因型检测：将所有研究对象外周血，经离心分离处理获得血浆与血细胞。血细胞标本采用酚- 氯仿法提取DNA，完成提取后采用PCR-RFLR 基因分离技术检测研究对象的SNPs 基因型，PCR 扩增引物是：5'-ACT-CAGGAATCGGCTC TGAAGGTG-3'，5'-GATGTGGTGGCTGGTGGTCAAC GT-3'。PCR 体系如下：总体积20μL，含有约100ng DNA 1μL；2×Es Taq Master Mix10μL；ddH 207μL；Primer-F，Primer-R 各1μL。

酶切：完成扩增后采用5μl 通过Bg1I 内切酶静置过夜，给予3%琼脂糖凝胶电泳对所有样本酶切产物条带位置测定，评估SNPs 位点基因分型，研究时选取10%样本重复检测确定不同分型结果。

3.统计学方法

本研究采用SPSS21.0 与student-t 检验两个软件进行双侧检验，年龄、性别、吸烟与饮酒等资料采用χ2检验，采用goodness-of-fitχ2检测对照组是否符合Hardy-Weinberg 平衡。采用单因素及多因素logistics 回归计算，P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

结果

1.两组研究主体按照性别调整的吸烟率及饮酒率比较

本研究实验组与对照组性别形成男多女少差异，在吸烟率与饮酒率方面采用直接法比较，调整结果表示吸烟率与饮酒率高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.IncRNA MEG3 基因多态性结果

本研究总共筛选得出7 个IncRNA MEG3 基因多态性相关的SNPs 的生物学信息，两组在SPNs 中rs11160608 基因型频率中有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表2 两组研究主体按照性别调整的吸烟率及饮酒率比较

3.PCR 扩增及酶切

本研究中运用PCR-RFLP 方法进行位点基因型判断，实验组DNA 通过扩增与酶切后采取琼脂糖凝胶电泳。PCR 扩增产物为445pb，采用Bg1I 内切酶酶切后，根据酶切产物电泳结果评估基因分型，SNPs 基因rs11160608A＞C 位点各基因型的扩增条带及酶切情况，AA 纯合型突变基因型、AC 杂合型突变基因、CC 野生基因型，见图1～3。

表3 IncRNA MEG3 基因多态性结果

图1 SPNs 基因rs11160608AA 型基因测序图

图2 SPNs 基因rs11160608AC 型基因测序图

图3 SPNs 基因rs11160608CC 型基因测序图

表4 SNPs 与OSCC 的相关性logistics 回归分析

4.SNPs 与OSCC 的相关性分析

本研究结果显示，调整年龄、性别、吸烟与饮酒等相关因素后，SNPs 中rs11160608AC 型基因是与增加OSCC 风险增加密切相关，其他SNPs 未见与OSCC 风险的相关性。见表4。

5.rs11160608 多态性与OSCC 易感性分层分析

Hardy-Weinberg 平衡检测结果显示实验组和对照组分别为χ2＝3.514，P＝0.072 和χ2＝0.753，P＝0.518，表明研究对象具有群体代表性。将全部研究对象的年龄、性别、吸烟史、饮酒史等变量纳入logistics 回归分析发现，在年龄＞50 岁与吸烟群体，rs11160608 易感性之间的关系在共显性模型中差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表5 rs11160608 多态性与OSCC 易感性logistics 回归分层分析

讨论

LncRNA MEG3 来源于人类染色体14q32.3 中的印记基因的一类，作为临床报道中首个认同具有肿瘤抑制效果的LnCRNA[8]。LncRNA MEG3 在大量正常组织中呈现高表达，但在肺癌、鼻咽癌及卵巢癌等恶性肿瘤中表现为低表达，甚至部分未见表达，同时调控表达变化水平与肿瘤进程与患者预后具有相关性[9，10]。

既往文献报道，吸烟、饮酒是大量恶性肿瘤的危险因素，如食管鳞状细胞癌、口腔癌与头颈癌等[11，12]。本研究中采用对照组研究，利用性别进行调整后，实验组吸烟率51.92%、饮酒率66.67%仍较对照组更高，与既往研究结果中烟酒摄入可能会增加OSCC发病风险[13]。SPNs 基因通过转录形成LncRNA MEG3，继而通过表观遗传学修饰作用参与不同疾病发生发展并发挥重要作用[14，15]。本文通过分析MEG3 中SPNs 基因的多态性发现，rs11160608 位点作为MEG3 基因中的关键位点，该位点与不同疾病的易感性既往有大量临床报道[16，17]；Li X 等[18]针对西方国家群体分析该基因位点与糖尿病风险的关系研究，结果得出未见该位点的等位基因或基因频率在患者与正常对照组中有统计学意义。Lian Y 等[19]针对女性群体先兆子痫对照研究结果仍无统计学意义。Zhang CG 等[20]研究中国汉族群体的胃癌风险关系发现rs11160608 位点多态性与胃癌发病风险具有相关性。本研究首次报道MEG3 中SNPs 基因多态性rs11160608 位点与汉族群体OSCC 风险间的相关性。rs11160608 多态性是MEG3 中的内含子A＞C 变异，本研究重点分析MEG3 多态性对OSCC风险的相关性，进行分层分析，进一步发现＞50 岁的群体与吸烟群体中的rs11160608 该位点AC 基因型明显高于AA 与CC 型，提示该位点再特定群体中与OSCC 发病风险具有关联，但本研究仍需要深入分析，但因现阶段相关的研究报道较少，展开对比验证颇有难度。

综上所述，本研究通过病例与健康群体的对照研究， 分析了MEG4 中SNPs 基因多态性rs11160608 位点与OSCC 风险的关系，发现该位点的AC 基因型携带者在老年群体与吸烟群体中患OSCC 的风险显著更高，该结果提示MEG3 多态性与OSCC 风险有关，帮助对OSCC 疾病性发展的认知。但由于本研究中纳入样本量较小，同时缺乏深入功能机理参考，后期应加大样本含量深入分析。