CD44V4 和nm23 在三阴性乳腺癌中的表达及其相关性

李 俊 李春英

1.广西壮族自治区柳州市柳铁中心医院甲乳疝外科，广西柳州 545007；2.广西壮族自治区柳州市柳铁中心医院病理科，广西柳州 545007

三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、表皮生长因子受体（Her-2）阴性的状态，在乳腺癌各分子分型中占15%～20%[1]。TNBC 有很强的异质性，其远处复发率和死亡率高于其他各型，但在治疗上却缺乏有效的手段，因而寻找新的靶向标志物以指导最佳治疗一直是TNBC 研究的焦点[2]。CD44V4 是细胞黏附分子CD44变异型V 家族中的一员，参与细胞-细胞、细胞-胞外基质之间的特异性黏附，目前发现与多种恶性肿瘤的浸润、转移有关[3-4]。nm23 是转移抑制基因，在细胞增殖、分化、癌变和肿瘤转移中起重要作用，其下调与许多癌症预后不良有关[5]，其在乳腺癌中的表达也是判断淋巴结转移的重要因素[6]。本课题前期的研究已发现CD44V4 同乳腺浸润性导管癌不良临床病理指标有关，但两者在TNBC 中的表达情况及与临床病理特征的相关性研究均少见报道。本研究探讨CD44V4和nm23 在TNBC 中的表达及在肿瘤侵袭性生物学行为中的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010 年1 月～2015 年3 月广西壮族自治区柳州市柳铁中心医院（以下简称“我院”）收治的浸润性乳腺癌140 例为研究对象，其中TNBC 患者70 例设为研究组，非TNBC 患者70 例设为对照组。纳入标准：①病理确诊浸润性乳腺癌，ER、PR、Her-2 检测结果判定及分子分型参照指南标准[7]；②年龄18～73 岁；③术前未进行新辅助治疗，术后根据免疫组化结果接受辅助治疗；④临床病理资料完整且患者知情同意。排除标准：①术前合并其他恶性肿瘤；②术前存在远处转移。入选患者均为女性，研究组年龄29～68 岁，中位年龄49.5 岁；对照组年龄32～73 岁，中位年龄54 岁。病理组织学分级采用Scarff-Bloom-Richardson 分级法分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ级。两组患者年龄、月经状况、病理组织学分级及临床分期等基本资料比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会审批通过。

1.2 免疫组化检测方法

应用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法检测CD44V4 和nm23，第一抗体CD44V4和nm23 的SP 试剂盒（KIT-5001 批号：AD06017896，KIT-9710 批号：180711139a）均由福州迈新生物技术有限公司提供，所有操作依据试剂盒说明书进行。阳性对照为已知阳性切片，磷酸缓冲盐溶液（PBS）代替一抗作为阴性对照。

1.3 阳性结果判定标准

从每例标本石蜡切片中随机取5 张进行免疫组化染色，在显微镜下随机选取不重叠的10 个高倍视野阳性细胞进行计数，2 人双盲观测。CD44V4 阳性表达为胞膜或胞质棕黄色均匀染色或呈颗粒状。结果判定根据阳性细胞数量和染色强度综合判断[8]，按阳性细胞占总细胞数的百分比评分：阳性细胞数≤5%为0 分，>5%～25%为1 分，>25%～75%为2 分，＞75%为3 分；染色强度评分：0 分为无着色，1 分为浅黄色，2 分为黄色，3 分为棕黄色；取两项评分乘积作为总积分，≤1分为阴性，＞1 分为阳性。nm23 阳性表达为胞浆中棕黄色颗粒，结果判定按照综合染色强度和细胞数进行[9]，染色强度评分与CD44V4 一致；阳性细胞数＜10%为0分；10%～50%为1 分；>50%～75%为2 分；＞75%为3分。两项相加后0～1 分为阴性，≥2 分为阳性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件对所得数据进行分析，计数资料采用百分率表示，采用χ2检验，分析两变量间的相关性采用Spearman 秩相关分析，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD44V4 和nm23 在TNBC 和非TNBC 中的表达情况

研究组70 例癌组织中，CD44V4 阳性表达率明显高于对照组，nm23 的阳性表达率明显低于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 CD44V4 和nm23 在TNBC和非TNBC中的表达情况[例（%）]

2.2 TNBC 患者CD44V4 和nm23 阳性表达与临床病理参数的关系

TNBC 癌组织中CD44V4 阳性表达与脉管浸润及淋巴结转移有关（P ＜0.05），与患者年龄、原发瘤大小、TNM 分期、病理组织学分级无关（P ＞0.05）；nm23阳性表达与淋巴结转移有关（P ＜0.05），与其他病理参数无明显相关性（P ＞0.05）。见表2。

2.3 CD44V4 与nm23 表达的相关性

秩相关性检验显示CD44V4 和nm23 之间无明显相关性（rs=-0.166，P ＞0.05）。

3 讨论

肿瘤转移是乳腺癌患者死亡的主要原因[10]。转移的发生需要肿瘤细胞成功地完成转移级联的每一步，包括从原发肿瘤脱离、向局部组织迁移和侵袭、在循环和淋巴系统中存活，最终在人体的远处器官上定植。TNBC 是乳腺癌分子分型中预后最差的一型，由不同基因表达谱组成，虽然各亚组间预后存在较大差异，但其无病生存和总体生存仍较差，是预后不良的独立危险因素[11-12]。为此，研究者们都在尝试寻找新的预后生物标志物，用以鉴别预后更差的TNBC 患者，并作为临床治疗的靶点。

表2 TNBC 患者临床病理参数与CD44V4 和nm23 阳性表达的关系[例（%）]

本研究对CD44V4 在TNBC 和非TNBC 中的表达进行免疫组化检测，结果显示：CD44V4 在TNBC 中阳性表达明显高于非TNBC，且其在TNBC 中的表达与脉管浸润、淋巴结转移相关。这说明CD44V4 可能参与了TNBC 的恶性进展，增强了肿瘤细胞的侵袭性。CD44V4 是细胞黏附因子CD44 变异体的一员，是参与恶性肿瘤转移的重要因子[3-4,13]，在乳腺癌的复发转移中也起着重要作用[14]。基础研究证实，肿瘤浸润转移的一个关键步骤就是脱落的肿瘤细胞穿过血管内皮进而迁移，在这个过程中，内皮细胞E-选择素起着举足轻重的作用[15]，而CD44V4 则是介导乳腺癌细胞跨内皮转移的一个主要的E-选择素配体[16]。乳腺癌脱落细胞上的E-选择素配体CD44V4 与血管内皮细胞上表达的E 选择素结合，介导黏附过程[14]，促进了肿瘤细胞脱离原发灶向远处的转移过程。

本研究对TNBC 和非TNBC 中nm23 蛋白表达进行检测，发现其在TNBC 组中的阳性表达率明显低于非TNBC 组，在TNBC 无淋巴结转移者阳性表达率及表达强度明显高于腋窝淋巴结转移者，差异有统计学意义（P ＜0.05）。这与Iqbal 等[17]的基础研究和Han等[6]的循证分析结果一致，说明nm23 基因的表达与乳腺癌高转移潜能呈相关性，其下调可触发肿瘤转移进程。nm23 家族是肿瘤转移抑制基因，目前认为其主要通过3 个方面调控肿瘤的侵袭转移：①通过与多种基因相互作用调控肿瘤侵袭转移过程；②参与信号传导通路的改变调控肿瘤转移；③通过影响细胞迁徙运动而调控肿瘤转移[18-20]。虽然有学者认为nm23 编码的部分蛋白在某些肿瘤中具有促进转移的作用[17]，但与乳腺癌侵袭转移相关的观点却是一致的。

在腋窝淋巴结转移这一病理参数研究中，本研究对CD44V4 过表达和nm23 低表达是否有关联进行了相关性检测，以期待其联合检测能否增加对预后的判断，但相关性分析显示两者表达无明显相关性。原因可能为：①CD44V4 介导乳腺癌转移是通过选择素家族血管内皮E 选择素实现，而nm23 对转移的调控是与其他种类的黏附因子联合完成，两者之间确实没有相关性；②选取的TNBC 患者未按基因表型进一步分亚型研究，使结果出现偏差，未能找到两者的关联。因此本研究的实验分析并不能完全认定CD44V4 与nm23无关联性，还需要做更多的深入研究。

综上所述，检测CD44V4 和nm23 在TNBC 中的表达及侵袭转移中的关系有重要价值，可能成为判断TNBC 预后的新生物标志物。