ITS rDNA高通量测序研究不同饲养方式对滩羊瘤胃真菌菌群的影响

张洁，李娜，郭婷婷，胡丹丹，徐晓锋，张力莉

(宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021)

滩羊系蒙古羊的一个分支，国家二级保护动物，是我国特有的裘用地方绵羊品种，且具有良好的肉用价值.传统的滩羊具有耐粗饲、擅游牧、耐寒的特点.自2003年宁夏地区滩羊的饲养管理方式由放牧转变为舍饲以来，舍饲为滩羊提供相对更为集中的生长环境和较高营养水平的饲粮.滩羊为反刍动物，其营养物质的消化吸收主要通过瘤胃微生物作用，而瘤胃中厌氧真菌游动孢子数为(103～105)/mL，瘤胃真菌的生物量约占瘤胃微生物总量的 8%[1].厌氧真菌可利用的底物非常广泛，包括多种可溶性多糖，如葡萄糖、果糖、纤维二糖和麦芽糖等，此外还包括复杂的结构性多糖和胆存性多糖等[2].纤维素、半纤维素以及木质素经多种化学键复合而形成天然木质纤维素，这种复杂的高分子化合物很难被任何单一的水解酶降解、破坏[3]，而厌氧真菌能够产生多种高活性的酶，具有穿透植物表面角质层和细胞壁木质化组织的独特能力[1,4]，完成对其的降解利用.此外，它们比瘤胃细菌能更大程度地消化小麦和大麦秸秆等难消化粗饲料，消化率达到 37%～50%[5].瘤胃真菌菌群结构的多样性和丰度反映了反刍动物营养物质消化吸收的水平.ITS rDNA高通量测序技术与传统测序相比测序更为准确、通量更高[6]，但目前使用ITS rDNA高通量测序技术研究滩羊瘤胃真菌的较少.因此本试验拟采用ITS rDNA高通量测序技术研究不同饲养方式下滩羊瘤胃真菌菌群多样性和丰度的变化，为进一步探究瘤胃真菌代谢机理、提高饲料消化率提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验动物与管理

选择体质量接近、健康状况良好的4月龄滩羊24只，分为2组，每组12只.放牧滩羊饲料为混合牧草(短花针茅、隐子草、牛枝子、狗尾草以及柠条等).舍饲滩羊饲料(精料∶粗料=3∶7，粗料为柠条，玉米秸秆、甘草秧、苦豆秧，精料原料为玉米、大豆粕、麸皮).舍饲组滩羊日粮组成及营养水平见表1.

表1 舍饲组滩羊日粮组成及营养成分

1.2 样品采集与处理

滩羊于9月龄屠宰后取瘤胃液，采用四层纱布过滤分别收集其瘤胃液，共10个样品，其中放牧组5个样品(G9-1,G9-2,G9-3,G9-4,G9-5)，舍饲组5个样品(R9-1,R9-2,R9-3,R9-4,R9-5).将采集的瘤胃液转移至实验室内，并分别取过滤后瘤胃液50 mL于离心管中，放置于-80 ℃冰箱冻存用于菌群分析测定.

1.3 PCR扩增

1.3.1 DNA提取 采用广州美基生物科技有限公司DNA提取试剂盒HiPure Stool DNA Kits 提取，具体方法参照说明书.

1.3.2 PCR扩增 瘤胃样品提取基因组DNA以后，为保证后续试验的准确性和可靠性，对稀释过的基因组DNA进行PCR扩增预试验.真菌核糖体基因转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)是位于真菌核糖体DNA(rDNA)上18S和28S基因之间的区域片段，主要包括ITS1和ITS2.提取收集的放牧组和舍饲组滩羊瘤胃液基因组DNA后，对ITS2区进行特异性扩增，扩增使用购自日本TOYOBO的KOD酶扩增体系、KOD酶、Buffer KOD、dNTPs、MgSO4，用特异引物扩增ITS rDNA的ITS2区.引物序列参照Toju等[7]的研究报道，引物序列为：

KYO2F：GATGAAGAACGYAGYRAA

ITS4R：TCCTCCGCTTATTGATATGC

1.4 Hiseq测序

使用核酸纯化试剂盒AMPure XP Beads对扩增产物进行纯化，用ABI StepOnePlus Real-Time PCR System(Life Technologies)进行定量，于广州基迪奥生物科技有限公司Illumina Hiseq2500的PE250模式pooling上机测序.

1.5 试验步骤

1.5.1 聚类分析 为进行菌群遗传学研究，去除低质量序列，人为设定分类单元，将具有97%相似性样品的有效序列聚类为一个OTU，并分别计算每个OTU在样品中的有效序列的绝对丰度和相对信息.为评价测序量是否足够，间接反映样品中物种的丰富程度，根据已测得序列中已知的 OTU(Operational Taxonomic Units)的相对比例，随机抽取序列，计算期望的OTU值，将抽取的序列数和对应的OTU期望值制成OTU稀释曲线，同理，根据已知的Shannon指数相对比例，抽取序列计算相应的Shannon指数期望值，并制成Shannon稀释曲线.OTU稀释曲线随着序列数目的增加，曲线趋向于平缓时，表明测序量已满足试验要求，测序深度已基本覆盖样本所有物种.

微生物物种生物学分类一般为界、门、纲、目、科、属、种7个水平，而聚类所得的OTU则为某一分类水平的集合，将OTU中丰度最高的序列作为代表性序列，与数据库进行物种注释.分析结果可与实际物种进行联系，研究不同作用条件下样品物种的变化.

1.5.2 PCOA主坐标分析 PCOA主坐标分析是基于OTU所显示物种丰度的情况，运用方差分析找出主要因素和结构，通过横坐标和纵坐标展现样本间相似性.根据坐标上距离的大小可判断样品间的相似性，样品越相似距离越相近，不同环境的样本可能出现各自聚集的情况.

1.5.3 α多样性分析 α多样性分析是指特定环境和生态系统内被生物隔离的情况，通常用物种多样性和丰富度进行描述.常用的α多样性指数有Chao1、ACE、Shannon、Simpson和Good’s Coverage.Chao1、ACE值s可通过不同的算法对样本进行OTU数目的估算及预测ACE、Chao1值.Shannon指数越大，Simpson指数越接近1，则表示样本的物种多样性越高.

1.5.4 组间差异分析 利用LEFse分析组间菌群差异，找出各组间特异的主要菌群，再利用LEFse软件对差异组间进行分析.LEFse首先对两组样品进行kruskal-Wallis秩和检验(一种多样本比较的检验方法)，检测出组间丰度上有显著差异的物种，再将筛选出的差异物种通过wilcoxon秩和检验(一种两样本成组比较的检验方法)进行两两组间比较，最后将筛选出的差异使用LDA(Linear discriminant analysis)分析，再将结果进行排序制图.图中可展示不同组中丰度差异显著的物种，柱状图的长度代表差异物种的影响力大小(即为LDA Score).随后将差异映射到已知层级结构的分类树上，得到进化分支图.在进化分支图中，由内至外辐射的圆圈代表了由门至属(或种)的分类级别.在不同分类级别上的每一个小圆圈代表该水平下的一个分类，小圆圈直径大小与相对丰度大小呈正比.着色原则：无显著差异的物种统一着色为黄色.

1.6 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 ITSr DNA基因ITS2区域扩增结果

如图1所示，图中16、17、18、19、20为放牧组，41、42、43、44、45为舍饲组，扩增后所得的条带大小正确，浓度适宜且条带单一，可继续进行后续的测序工作.

图1 样本ITS rDNA基因 ITS2区域扩增结果Figure 1 Amplification results with ITS2 region of ITS rDNA gene of sample

2.2 OTU稀释曲线和OTU Shannon稀释曲线

由图2可知，该测序在测序量达2 500时，OTU稀释曲线趋于平缓，测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种.Shannon指数反映样品中物种的多样性，当Shannon稀释曲线随测序量的增加趋向于平缓时，表明测序量已满足要求，测序深度的继续增加已经不影响物种的多样性.由图3可知，该测序在测序量达2 500时，Shannon稀释曲线趋于平缓，测序量趋于饱和，对样品物种多样性不构成影响.

图2 滩羊瘤胃真菌OTU稀释曲线Figure 2 OTU dilution curve of rumen fungus in Tan sheep

图3 滩羊瘤胃真菌OTU Shannon稀释曲线Figure 3 OTU Shannon dilution curve of rumen fungi in Tan sheep

2.3 滩羊瘤胃真菌菌群OTU分析

对试验样品进行聚类分析，分别得到样品的OTU值，将不同组样品共有和特有的高丰度OTU并集(平均丰度大于1)制成韦恩图(图4)，并对两组样品的OTU数进行差异性比较(表2).由图4可知，放牧组与舍饲组共有的OTU数为132，共有的OTU占放牧组总OTU数的38.71%，占舍饲组总OTU数的55.23%.由表2可知，放牧组OTU数量极显著的高于舍饲组(P<0.01).表明舍饲方式下的滩羊瘤胃真菌菌群的物种丰富度和多样性降低.

图4 放牧组和舍饲组瘤胃中真菌OTUs绘制韦恩图Figure 4 Venn diagram of OTUs in the rumen of the grazing group and barn feeding group

2.4 物种分类分析

将两组样品的物种注释结果制成物种分类树(图5).由图5可知，两组样品的真菌物种主要分布于新丽鞭毛菌门(Neocallimastigomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)，放牧组瘤胃真菌的丰度所占比例超过2组真菌丰度之的3/4，新丽鞭毛菌门基本只存在于放牧组.相较于放牧组，舍饲组真菌丰度占真菌总和不足1/4，多在担子菌门和子囊菌门分布.表明舍饲方式降低了滩羊瘤胃内真菌的丰度，且菌群结构发生变化，导致两种饲养方式的优势菌产生差异.

表2 滩羊瘤胃液真菌OTU数

图5 滩羊瘤胃液真菌物种分类树Figure 5 Classification tree of rumen fluid fungi in Tan sheep

2.5 滩羊瘤胃真菌菌群PCOA分析

PCOA分析结果如图6所示，第一主坐标贡献率为29.34%，第二主坐标贡献率为18.53%，横纵坐标上放牧组与舍饲组组间彼此分开，组内距离较小且各组内出现部分聚集，舍饲组相对于放牧组组内各样本之间距离更近.说明两组物种丰度组间差异明显，而组内差异较小，舍饲组相对于放牧组物种均匀度更好，组内各样本相似性更高.

2.6 滩羊瘤胃真菌菌群α多样性分析

滩羊瘤胃真菌菌群α多样性分析结果表明(表3)，放牧组ACE值极显著高于舍饲组(P<0.01)，放牧组Chao1值显著高于舍饲组(P<0.05)，而舍饲组Shannon指数极显著高于放牧组(P<0.01)，舍饲组Simpson指数显著高于放牧组(P<0.05)，两组Coverage指数没有显著差异.表明放牧组物种丰富度高于舍饲组，但舍饲组物种均匀度高于放牧组.2组物种覆盖率均达99%以上，说明数据可科学充分地反映滩羊瘤胃真菌菌群的实际情况.

图6 滩羊瘤胃液真菌PCOA分析Figure 6 PCOA analysis of rumen fluid fungi in Tan sheep

表3 放牧组和舍饲组样品多样性指数

同行无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01).

In the same row，values with no letter superscripts mean no significant difference (P<0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01).

2.7 瘤胃真菌菌群结构分析

2.7.1 门水平 在门水平上，两组共涉及新丽鞭毛菌门(Neocallimastigomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、未注释菌门(Fungi_NA)、子囊菌门(Ascomycota)、孢霉菌门(Mortierellomycota)、壹菌门(Chytridiomycota)6个门(表4).由表4可知，在门水平上，壹菌门(Chytridiomycota)为舍饲组特异性菌门.与放牧组相比，新丽鞭毛菌门(Neocallimastigomycota)的丰度显著降低(P<0.05)，未注释菌门(Fungi_NA)和担子菌门(Basidiomycota)的丰度有提高的趋势(P<0.075)，子囊菌门(Ascomycota)的丰度提高75.10%，但差异不显著.表明滩羊瘤胃真菌的分布在门水平显现出明显的不同，不同饲养方式对滩羊瘤胃真菌菌群具有不同的影响.

表4 不同饲养方式对滩羊瘤胃真菌丰度在门水平上的影响

同行无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01).

In the same row，values with no letter superscripts mean no significant difference (P<0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01).

2.7.2 属水平 在属水平上，2组共涉及61个属，有6个属特异性存在于放牧组，有10个属特异性存在于舍饲粗.2组之间有19个属的丰度存在显著差异(P<0.05)，未注释属(NA)、梨霉属(Piromyces)、新丽鞭毛菌属(Neocallimastix)、裂褶菌属(Schizophyllum)、附球菌属(Epicoccum)、广义酿酒酵母(Kazachstania)、隐球菌(Cryptococcus)、未定义新丽鞭毛菌科(Neocallimastigaceae_NA)为两组瘤胃真菌丰度较高的属(表5).由表5可知，与放牧组相比，未定义属(NA)丰度极显著提高(P<0.01)，梨霉属(Piromyces)的丰度显著降低(P<0.05)，节担菌属(Wallemia)和新丽鞭毛菌属(Neocallimastix)的丰度显著提高(P<0.05)，广义酿酒酵母菌属(Kazachstania)丰度提高47.20%，但差异不显著.表明不同饲养下的滩羊瘤胃真菌在属水平上的分布存在差异，优势菌属所占比重发生变化.

2.8 菌群结构组间差异分析

由图7和表6可知，舍饲组皱孔菌科(Meruliaceae)、多孔菌目(Polyporales)、附球菌属(Epicoccum)极显著高于放牧组(P<0.01),组间差异影响力达到4.0以上.其中皱孔菌科(Meruliaceae)、多孔菌目(Polyporales)同属于担子菌门.

表5 不同饲养方式对滩羊瘤胃真菌丰度在属水平上的影响

同行无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01).

In the same row，values with no letter superscripts mean no significant difference (P<0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01).

图7 LEFse差异分析图Figure 7 LEFse difference analysis diagram

表6 LEFse差异分析表

3 讨论

由前人的研究可知，日粮为瘤胃微生物最主要的影响因素[8-10]，全干草日粮中添加精料或精粗比增加可导致瘤胃真菌数量下降[11]，优势菌形态发生变化[12].同样李亚丹等[13]研究发现混合饲粮饲养的黄牛真菌物种较分散，而单一芒草饲养的黄牛真菌相对较集中.但有些常见真菌并不受或受很小来自日粮的影响[14].本试验条件下，放牧组滩羊瘤胃真菌菌群的物种多样性显著的高于舍饲组，舍饲组滩羊瘤胃真菌菌群的物种均匀度显著高于放牧组，这与前人的研究结果相一致，即舍饲方式下进食日粮相比放牧较单一，瘤胃真菌菌群多样性降低、均匀度升高.而耐高盐的担子菌门在舍饲组丰度的提高，进一步表明因饲养方式的不同，瘤胃内真菌会适时构建适合自身生长所需的区系.王照华等[12]研究发现不同日粮精粗比对优势真菌的比例会产生影响.由Pitta等[15]的报道可知，用不同饲料喂养牛，由于饲料中植物种类不同，其木质纤维的组成成分也不相同，降解过程所依赖的真菌种类和比例也会发生的相应变化.在本试验条件下，在门水平上和属水平上两组菌属丰度具有明显差异，且舍饲组未注释菌门和未注释菌属的丰度提高，优势菌丰度发生变化.表明不同的饲养方式因饲喂日粮的不同导致滩羊瘤胃真菌菌群结构发生变化，且舍饲滩羊瘤胃内未注释菌种类增多，舍饲组菌属组成发生变化.

有研究证实，在无瘤胃细菌存在条件下，瘤胃真菌能完成粗纤维饲料中的干物质62%的降解[16].高爱武[17]在驱除真菌对绵羊纤维降解率影响的研究中发现，高纤维日粮条件下，驱除绵羊瘤胃中厌氧真菌会导致纤维物质降解率降低，再次引入真菌后，绵羊对纤维的降解率具有回升的趋势，瘤胃真菌在纤维降解中起重要作用.瘤胃厌氧真菌生产高活性的多种纤维素酶和半纤维素酶，特别是β-葡聚糖酶、木聚糖酶、木聚糖脱支酶[18-20]和几丁质酶[21].可将植物细胞壁蛋白、果胶和碳水化合物降解为单体.反刍动物摄入植物总量的30%～35%的生物降解可归因于这类瘤胃微生物[22-23].瘤胃真菌对于粗纤维饲料的降解发挥着重大作用，瘤胃中真菌的丰度可间接反映机体对于粗纤维饲料消化水平的高低.在本试验条件下，放牧组真菌的物种丰度所占比例超过两组总菌数量的3/4，舍饲组真菌丰度占真菌总和不足1/4，舍饲组滩羊瘤胃内真菌丰度明显低于放牧组，因而导致舍饲方式下滩羊瘤胃对纤维的降解水平下降，这可能与舍饲滩羊舍饲日粮相较于放牧所含纤维较少有关.且两组所含真菌中丰度最高的新丽鞭毛菌门是水牛瘤胃中主要的厌氧真菌之一，具有高效消化纤维素生物质的能力[24-27]，但却大多存在于放牧组.朱崇淼等[28]报道称精料能抑制真菌木聚糖异构酶的产生，木聚糖异构酶的产生可能与粗纤维类底物的诱导有关.梨霉属可产生木聚糖异构酶，促进纤维素降解的菌属[29-30].试验结果表明，梨霉属在放牧组丰度达61.84%，舍饲组仅19.93%，放牧组木聚糖异构酶产生量及纤维降解能力显著高于舍饲组.进一步说明舍饲方式不利于滩羊瘤胃纤维菌的生长.且前人的研究结果表明，体外培养时培养基中可溶性糖如纤维二糖、葡萄糖和麦芽糖的存在对微生物降解纤维素有不利影响[31-32]，当日粮组成纤维含量较高时，厌氧真菌的数量增加，反之厌氧真菌数量则低[33-34].广义酿酒酵母菌属为酿酒酵母的一种，可发酵葡萄糖[35].本试验条件下，广义酿酒酵母菌属在舍饲组丰度达44.09%，放牧组29.95%，舍饲组较放牧组而言，发酵葡萄糖的水平更高、可溶性糖含量较高.因此可能是舍饲组滩羊瘤胃中可溶性糖快速发酵，发酵葡萄糖的真菌属丰度升高，抑制了纤维降解菌的生长[12]，降解纤维的能力降低；放牧组滩羊因采食饲粮全部为粗饲料，含有更高水平的纤维与半纤维可促进厌氧真菌生长，粗饲料纤维的降解水平更高.

4 结论

不同的饲养方式因饲喂日粮的不同导致滩羊瘤胃真菌菌群结构发生变化，舍饲滩羊因日粮精料的供给菌群多样性和物种丰富度降低，而因统一饲喂同一日粮，真菌菌群的均匀度提高，舍饲组菌属组成发生变化.

舍饲方式下瘤胃真菌菌群的优势菌比例发生变化，减少了与纤维素、半纤维素降解有关的新丽鞭毛菌门、梨霉属的丰度，提高了耐高盐的担子菌门和降解葡萄糖有关的广义酿酒酵母菌属丰度.