新疆部分地区蜱传斑点热立克次体的分子流行病学研究

曲志强，林汉亮，许肖枫，马力克·艾则孜，罗毅，马站，孙晓林，刘光远

(1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070； 2.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室，农业部草食动物疫病重点开放实验室，甘肃 兰州 730046；3.新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，新疆 乌鲁木齐 830011)

蜱隶属节肢动物门(Arthropoda)，蜘蛛纲(Arachnida)，螨亚纲(Acari)，寄螨总目(Parasitiformes)，蜱目(Ixodida)，分为3个科：硬蜱科(Ixodidae)、软蜱科(Argasidae)和纳蜱科(Nuttalliellidae)，其中主要以硬蜱科为主[1-3].蜱是一类营吸血性外寄生虫，是仅次于蚊类的世界第2大传播媒介，可传播众多诸如病毒，细菌以及寄生虫等人和动物的重要疾病[1，4]，对人类健康和畜牧养殖业造成了极大危害[4].

斑点热立克次体是一类人兽共患的自然疫源性疾病，主要传播媒介为蜱、螨[5]，又称其为蜱热或蜱传斑疹伤寒[6].可以分为3大类群，包括斑疹热组(spotted fever group，SFGR)、斑疹伤寒组(typhus group，TG)及丛林斑疹伤寒(scrub typhus group，STG)[7]，是一类原核生物型、短小棒状或球形状、革兰染色阴性的专性细胞内繁殖的微生物[8]，优势类群为SFGR.我国报道的SFGR有10种，其中在新疆分布的蜱种体内发现的SFGR有7种，包括埃氏立克次体(R.aeschlimannii)，康氏立克次体(R.conorii)，拉欧蒂立克次体(R.raoultii)，西伯利亚立克次体(Rickettsiasibirica)，斯洛伐克立克次体(R.slovaca)马赛立克次体(R.massiliae)，和暂定巴布瑞立克次体(CandidatusR.barbariae)[9-10].

新疆占中国国土面积的六分之一，与8个国家接壤拥有5 600 km长的边界线[11]，是我国5大牧场之一[12].位于东亚和欧洲之间的古丝绸之路上，国际牲畜贸易频繁[13]，同时也增加了外来病原的传播风险.试验选择不同地域环境的5地(州)10个县(市)为调查区域，在4～5月份新疆蜱虫活动高峰期对其进行采集[14]，对蜱传斑点热立克次体病原进行检测，通过流行病学调查有助于了解新疆部分地区SFGR病原的流行情况和现状，为蜱传斑点热立克次体病原的预防和控制提供一定的数据支持.

1 材料与方法

1.1 试剂与耗材

1.2 仪器与设备

超净工作台(必威安泰 BHC1300)，普通PCR仪(Bio-RAD)，核酸电泳仪(北京六一仪器 DYY-12型)，全自动凝胶成像仪(培洁科技，SKL-4-01-018)恒温震荡仪(eppendorf)，4 ℃离心机(Eddendorf centrifuge 5810R)，水浴锅(上海精宏实验设备有限公司).

1.3 蜱的采集与鉴定

2018年4～5月新疆蜱种活跃高峰期时，对新疆喀什地区、克孜勒苏州、伊犁州、塔城地区、阿尔泰地区5个地州的叶城县、阿图什市、阿合奇县、伊宁市、新源县、尼勒克县、察县、巩留县、塔城市、吉木乃县10个边境县(市)(图1)，采用人工布旗法对游离蜱和寄生于家畜体表的蜱进行采集，实验室利用形态学结合分子生物学方法进行种类鉴定[2].

图1 样品采集地区Figure 1 The regional map of sample collection area

1.4 蜱DNA的提取

1.5 引物设计与目的基因扩增

以SFGR外膜蛋白A基因(ompA)设计引物并进行PCR扩增.引物序列 ：Rr190.70p 5′-ATG GCGAATATTTCTCCAAAA-3′和Rr190.701n 5′-GTTCCGTTAATGGCAGCATCT-3′.PCR扩增体系为25 μL：预混酶13 μL，水8 μL，模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL.反应条件为95 ℃ 3 min；95 ℃ 30s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，34个循环；72 ℃ 5 min.将PCR扩增阳性结果进行胶回收，将胶回收产物与T-Easy载体连接，转入JM109感受态细胞中，加入IPTG(0.1 mol/L)和X-Gal后均匀涂布于LB平板上，37 ℃倒置培养过夜.挑取白色菌斑进行摇菌培养，将检测为阳性的菌液送西安擎科泽西生物科技有限公司测序.

1.6 序列比对及进化分析

将测序结果整理后上传至NCBI中进行BLAST，通过比对结果验证测序结果的正确性和所扩增病原属于那一种病原或与那种病原同源性较高.然后利用MEGA 6.0软件的NJ(neighbor Joining)法构建系统发生树，分析来自不同地区和不同种病原的进化关系.

2 结果与分析

2.1 蜱虫的分类与鉴定

对新疆10个边境县(市)采集到的游离蜱、饱血或半饱血蜱共2 079只进行分类鉴定，经鉴定，采集的蜱虫共包括3属7个种，革蜱属的蜱有森林革蜱(Dermacentorsilvarum)、草原革蜱(D.nuttalli)、胫距革蜱(D.pavlovskyi)；璃眼蜱属有小亚璃眼蜱(Hyalommaanatolicum)、麻点璃眼蜱(H.rufipes)、亚洲璃眼蜱(H.asiaticum)；扇头蜱属为血红扇头蜱(Rhipicephalussanguineus).

2.2 SFGR病原基因组的PCR扩增结果

以SFGR 外膜蛋白基因ompA设计的引物70p/701n对新疆蜱虫基因组进行扩增，扩增得到589 bp的基因片段(见图2)，对扩增结果经测序和序列比对分析，结果共检测出6种斑点热立克次体病原，包括：拉欧蒂立克次体(Rickettsiaraoultii)、西伯利亚立克次体(Rickettsiasibirica)、斯洛伐克立克次体(Rickettsiaslovaca)、埃氏立克次体(Rickettsiaaeschlimannii)和2株未定种(CandidatusRickettsia)，其中一株未定种为暂定巴布瑞立克次体(CandidatusR.barbariae).

对不同地区的蜱种和病原检测结果进行数据统计，结果如表2.1.调查结果显示，阳性率高于50%的地区有6个县(市)，占被检地区的60%.阳性率超过70%的地区为阿图什市、伊宁市和新源县，平均阳性率也高达51.5%，不同蜱种间的感染率为1.1%～80%.

M：DNA分子质量标准；1：SFGR 病原基因.M：DL2000 Marker；1：SFGR pathogen gene.图2 SFGR病原基因组PCR扩增结果Figure 2 The PCR amplification results of SFGR pathogen genome

通过对新疆不同地区SFGR病原阳性率和不同蜱种的病原阳性率进行统计，结果阳性率较高的地区为阿图什市、伊宁市和新源县(图3)；不同蜱种中，亚洲璃眼蜱、小亚璃眼蜱和森林革蜱的阳性检出率较高(图4).综合分析得知，被检各地的蜱虫分布种类不同，各自的阳性检出率也不尽相同，其中拉欧蒂立克次体主要由革蜱携带传播，埃氏立克次体主要是通过璃眼蜱进行感染.因此，存在革蜱和璃眼蜱的地区这2种病原较为流行.

图3 不同地区斑点热立克次体阳性率统计结果Figure 3 The statistical results of positive rate of SFGR in different areas

图4 不同蜱种中斑点热立克次体阳性率统计结果Figure 4 The statistical results of positive rate of SFGR among different ticks species

表1 不同蜱种和斑点热立克次体病原检测结果统计

2.3 系统进化分析与相似性比较

利用MEGA 6.0软件邻接法NJ构建新疆不同地区SFGR病原基因组扩增获得的核酸序列和NCBI下载的斑点热立克次体的核酸序列共同构建系统进化树，以嗜吞噬细胞无形体作为外群(图5)，通过对系统进化树分析得出，伊宁的未定种与暂定巴布瑞立克次体亲缘关系较近，其相似性达到了99.6%，与察县暂定巴布瑞立克次体的相似性为98.5%(图6)；所有拉欧蒂立克次体、埃氏立克次体、斯洛伐克立克次体和西伯利亚立克次体病原都能各自分在同一分支，且相似性较高.

图5 不同地区斑点热立克次分子体系统进化树分析Figure 5 Molecular phylogenetic tree analysis of SFGR in different areas

3 讨论与结论

此次调查从蜱虫活动高峰期的4～5月份对新疆10个边境县(市)的蜱进行采集，采集地区与哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦和巴基斯坦相邻.本次共采集到2 079只蜱，经鉴定包括3属7个蜱种，共检测出6种斑点热立克次体病原，其中主要以拉欧蒂立克次体病原最为常见和分布地区广泛.拉欧蒂立克次体最早发现于俄罗斯的草原革蜱(D.nuttalli)和短小扇头蜱(Rh.pumilio)中[15]，我国最早于2011年在新疆维吾尔自治区的森林革蜱(D.silvarum)中首次检测到SFGR病原[16]，与之前报道结果一致，拉欧蒂立克次体主要由革蜱携带传播[17].埃氏立克次体于1997年在莫斯科的边缘璃眼蜱(Hy.marginatummarginatum)内首次发现[18]，我国首次在伊宁县羊体表图兰扇头蜱(R.turanicus)和察布查尔县刻点血蜱(Haemaphysalispunctata)中发现其核酸的存在[19].璃眼蜱是埃氏立克次体的主要宿主，本研究从麻点璃眼蜱(Hy.rufipes)中检测到埃氏立克次体，也进一步证明了这一观点.与首次报道相比，本次从尼勒克县和巩留县检测出埃氏立克次体，说明该病原在新疆有扩展趋势，病原出现的地方增多.斯洛伐克立克次体主要分布于欧洲大部分国家，主要在革蜱属中检出；有研究指出斯洛伐克立克次体有可能在家畜中进行垂直传播[20]，在许多国家有人感染该病的报道[21-22]，妇女和12岁以下儿童为主要感染对象；而亚洲对该病的报道较少，我国首次报道该病于2012年，由田占成等在新疆新源县森林革蜱中发现[23].

图6 斑点热立克次体核酸序列相似性比较Figure 6 The Comparison of nucleic acid sequence similarity of Spotted fever group rickettsia nucleic acid sequences

斑点热立克次体可以引起人的严重疾病，对其进行流行病学研究具有重要意义[24].在以往的有关SFGR病原调查的报道中，全部为某一地区或某1个种的单一调查和报道.本研究较之前报道相比，采样范围广泛，涉及到的蜱虫种类多，检出的SFGR病原丰富，采样地均为边境地区，与3个国家接壤，具有一定的代表性.通过本次调查发现，SFGR病原在新疆地区广泛流行，各种生境均有分布，而且存在两种病原的交叉感染；这一现象大大增加了病原的检测和预防难度，加之新疆是我国重要的贸易口岸，与多个国家相邻，加剧了外来病原的入侵的可能.通过本次调查发现，较之前的报道相比，SFGR病原的种类和分布范围正在逐步扩大，有蔓延全境的趋势.依据本次调查结果，应该引起相关部门对本病的高度重视，做好SFGR病原的防控和预防措施，以防止疫情的进一步扩散与蔓延.