TLR4对母-胎界面滋养层细胞生物学行为的影响

宋 芳 杨美霞 贺 帅 黄世琪 郝 奋

包头医学院生殖医学研究所(014040)

Toll样受体4(TLR4)属于I型跨膜蛋白，是天然免疫系统中的一类重要模式识别受体，在调节炎症及免疫反应中起重要作用，可能参与自然流产的发生[1-3]。笔者前期研究亦发现，早期自然流产患者绒毛滋养层细胞和蜕膜细胞中TLR4表达均明显高于正常妊娠妇女，说明母-胎界面TLR4异常表达是导致妊娠失败的原因之一[4]。由此推测，在“着床窗”开放时，TLR4可能影响母-胎界面细胞生物学行为，但目前尚未见报道。因此，本实验利用小鼠胚泡与人蜕膜细胞共培养着床模型[5]，观察TLR4对胚泡滋养层细胞在母体蜕膜细胞上粘附和铺展的影响，揭示TLR4对胚胎着床的影响及作用环节，为临床治疗不孕症提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 组织来源

①蜕膜组织：来源于包头医学院第二附属医院妇产科妊娠5～6周的人工流产妇女，平均年龄30岁，月经周期正常，3个月内未用任何激素类药物。②实验动物：选用成年昆明种远交系小鼠(中国科学院动物研究所，7～9周龄，25～35g)，动情期雌鼠与雄鼠2∶1合笼，次日晨发现阴栓者为妊娠1d，于妊娠4d用颈椎脱臼法处死雌鼠，迅速剪开腹腔，在解剖镜下用PBS缓冲液冲洗双侧子宫角，收集胚泡，按照参考文献[6]的方法制备胚泡石蜡切片；同时将子宫用Bouin液固定，常规石蜡包埋制备组织切片。

1.2 主要试剂

小鼠抗人TLR4单克隆抗体为Santa Cruz公司产品，SP试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司，DAB显色试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。胎牛血清(FCS)和小牛血清白蛋白(BSA)为Hyclone公司产品。

1.3 免疫组织化学染色(SP法)

切片常规脱蜡水化，滴加过氧化物酶阻断溶液(试剂A)，室温孵育30min；滴加正常非免疫动物血清(试剂B)封闭30min；滴加小鼠抗人TLR4抗体(1:200)， 4℃过夜；滴加生物素标记的第二抗体(试剂C)，室温孵育15min；滴加链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂D)，室温孵育15min。DAB-H2O2室温显色，Mayer苏木精复染细胞核，脱水、透明、封片。阴性对照用PBS代替一抗，其余步骤同上。

1.4 人子宫蜕膜细胞的分离、纯化与鉴定

取人工流产蜕膜组织，按照参考文献[4]的方法分离纯化蜕膜细胞，以5×105个/ml密度接种于50ml细胞培养瓶内，37℃，5%CO2培养箱培养，细胞爬片用小鼠抗人波形蛋白抗体(1:100)检测纯度。

1.5 小鼠胚泡与人蜕膜细胞共培养

将消化重悬的蜕膜细胞以1×106个/ml密度加入到含15%FCS-199的培养皿中，待细胞增殖生长成层后，换用0.4%BSA-199培养，每皿中移入5～10个胚泡，在倒置显微镜下观察胚泡的粘附和铺展情况。取共培养72h细胞爬片，制备扫描电镜标本，观察小鼠滋养层细胞与人蜕膜细胞生长情况。

1.6 胚泡滋养层细胞的粘附与铺展

待细胞生长汇合成层后，实验组分别换用经0.4%BSA-199稀释的不同浓度(100、200、400ng/ml)抗TLR4抗体，对照组用无抗体的0.4%BSA-199进行培养。每皿移入15～20个胚泡，分别于培养24h、48、72h时在倒置显微镜下观察并记录胚泡的粘附和铺展情况。快速轻晃培养皿，胚泡不移动者为粘附；已粘附的胚泡滋养层细胞外延生长≥80μm者为铺展。分别于共培养24、48h统计粘附率和铺展率，于共培养72h用显微镜目测栅测量并计算铺展面积。相同实验至少重复3次，每组观察35～40个胚泡。

1.7 数据处理及统计学分析

2 结果

2.1 着床前小鼠胚泡和子宫内膜中TLR4蛋白表达

TLR4蛋白在小鼠胚泡的内细胞群和滋养层细胞的胞质内均有阳性表达，呈棕黄色(图1A、B、C)。TLR4在妊娠4d小鼠子宫内膜的蛋白表达主要定位在腔上皮细胞的游离面，深棕色阳性信号较强，腺上皮细胞和基质细胞表达较弱(图1D)。

A：早期胚泡 B：中期胚泡 C：晚期胚泡 D：妊娠4d子宫内膜 图1 TLR4蛋白在妊娠4d小鼠胚泡和子宫内膜的表达(×200)

2.2 蜕膜细胞的纯化和共培养着床模型的建立

蜕膜细胞培养18h即已贴壁，细胞呈圆形，24h后个别细胞开始伸出突起，呈成纤维细胞样(图2A)，培养9d后已全部汇合成层(图2B)。传代后，第三代蜕膜细胞用小鼠抗人波形蛋白抗体检测蜕膜细胞纯度，胞浆内有棕黄色阳性颗粒、细胞核不着色者为蜕膜细胞，其纯度均>95%(图2C)。

小鼠胚泡与人蜕膜细胞共培养72h，扫描电镜观察发现小鼠滋养层细胞的突起与人蜕膜细胞的突起相互接触(图3A)，并且可见滋养层细胞的突起伸入到蜕膜细胞下面(图3B)，说明体外共培养着床模型建立成功。

A：培养24h人蜕膜细胞，个别已贴壁(×150) B：培养第9天人蜕膜细胞，已汇合成层(×150) C：波形蛋白免疫组织化学染色显示蜕膜细胞(×200)图2 体外培养人蜕膜细胞

A：小鼠滋养层细胞(T)与人蜕膜细胞(D)相互接触 B：小鼠滋养层细胞(T)伸入人蜕膜细胞(D)下面图3 共培养72h扫描电镜观察

2.3 抗TLR4抗体对胚泡滋养层细胞粘附和铺展的影响

2.3.1对照组大多数胚泡于共培养12h脱去透明带，共培养24h，孵出的胚泡粘附到蜕膜细胞上，其粘附率为90.32%，未粘附的则悬浮在培养液中，而且不能进一步生长(图4A)；共培养48h，已粘附的胚泡滋养层细胞外延生长，铺展率为83.87%；共培养72h滋养层细胞明显向外扩展，平均扩展面积为(194.00×103) μm2(图4B)。

A：共培养24h，胚泡粘附到蜕膜细胞上 B：共培养48h，胚泡滋养层细胞外延生长 图4 对照组小鼠胚泡与人蜕膜细胞共培养(×150)

2.3.2实验组胚泡能正常孵出、粘附，但其滋养层细胞的外延生长明显受到抑制，各浓度组共培养72h的铺展情况如图5所示。3个不同浓度抗体组的粘附率分别与对照组相比无差异(P>0.05)，铺展率100ng/ml组、200ng/ml组、400ng/ml组分别与对照组相比有差异(P<0.01)。共培养72h抗体组滋养层细胞的扩展面积以剂量依赖的方式受到抑制，均低于对照组(P<0.01)。见表1。

A：对照组，胚泡滋养层细胞明显向外扩展 B：100ng/ml组，滋养层细胞外延生长，但扩展面积明显减小 C：200ng/ml组，扩展面积较对照组明显减小 D：400ng/ml组，局部滋养层细胞向外生长，扩展面积明显减小 图5 各组小鼠胚泡与人蜕膜细胞共培养72h(×150)

组别 粘附率(%) 铺展率(%) 扩展面积(×103μm2) 对照组 87.4±2.383.5±3.3194.1±8.2100ng/ml组78.5±2.5 64.3±4.0*63.49±5.0**200ng/ml组 82.3±2.651.3±4.1**60.2±5.2**400ng/ml组 77.3±3.046.2±4.2**58.5±4.86**

*与对照组相比P<0.05**与对照组相比P<0.01

3 讨论

正常妊娠可以看作是一种成功的同种半异体移植，母胎间存在着复杂的免疫应答和免疫调节机制，母体的免疫功能处于一定的耐受状态，是胚泡着床和维持妊娠的关键。胚泡着床是个复杂的生理过程。有研究证实，TLR4在胎盘滋养层细胞上有表达，其激活可诱导免疫应答，有利于机体抵抗病原微生物感染或组织损伤，但是过强的免疫反应也会带来不利影响[7]。代盈盈等[8]研究发现，TLR4在妊娠期关中奶山羊子宫的分布和表达具有一定的规律，并可能参与子宫的免疫和分泌调节功能。

由于体内研究无法人为地控制胚泡滋养层细胞的粘附和进一步的发育，难以准确地观察胚泡着床各阶段的变化以及各种相关因素间的协调作用。笔者参考Yoshimura等[5]建立的小鼠胚泡和人蜕膜细胞共培养的体外着床模型，与其不同的是，采用复合酶直接消化法，省去了Percoll密度梯度离心的复杂过程。根据早期胚胎对蜕膜组织无种属要求的特点，用妊娠4d小鼠胚泡与人蜕膜细胞共培养，72h时扫描电镜观察发现小鼠滋养层细胞的突起与人蜕膜细胞的突起相互接触，并且可见滋养层细胞的突起伸入到蜕膜细胞下面，证明建立的体外共培养着床模型是成功的，而且用于研究胚泡滋养层细胞的粘附和铺展情况可行。

为了研究TLR4在小鼠胚泡着床过程中的具体作用环节，在汇合成层的人蜕膜细胞中分别加入不同浓度抗TLR4抗体，与小鼠胚泡共培养，在倒置显微镜下观察并统计粘附率、铺展率及扩展面积。通过预实验在TLR4缺少的耐受范围内选择100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml 3个不同浓度。从实验结果看，抗TLR4抗体不影响胚泡的粘附，但明显抑制其铺展，并且这种抑制作用呈剂量依赖关系。由此可见，在滋养层细胞粘附、迁移、分化过程中，可能是由于TLR4介导的细胞内信号启动时间不同，其调节着床的机理可能是通过激活NF-kB进而影响细胞的行为，如粘附、增殖、分化等[9-10]。TLR4能识别并快速启动天然免疫反应，释放出各种炎症因子，激活各种免疫细胞抵抗微生物入侵，以维持正常妊娠，这与笔者的前期研究是一致的，即着床前随着卵巢类固醇激素分泌增加，子宫内膜IL-8的表达逐渐增强，为子宫内膜处于接受状态以更好地完成与胚胎之间的识别、粘附做准备，IL-8可趋化更多的中性粒细胞移入基质，分泌弹性蛋白酶，降解III型胶原蛋白，利于胚泡侵入子宫内膜[11]。由此可见，在胚胎着床过程中，可能是通过TLR4 -NF-κB通路激发炎症因子，如TNF-α、IL-2、IL-8等多种的炎性因子的释放，使胚泡滋养层细胞的侵入性和子宫内膜的接受性同步，保证着床顺利进行。

研究结果表明：TLR4在着床前胚泡的内细胞群和滋养层细胞均有表达，且不影响胚泡滋养层细胞的粘附，但对铺展有促进作用，说明TLR4参与小鼠胚泡着床，且作用环节不同，胚泡粘附、铺展以及滋养层细胞的进一步生长是由不同机制所介导。