染料木黄酮调控小鼠血管平滑肌细胞钙化的研究

沈 诚，赵树林，袁 烨

随着年龄的增加，动脉粥样硬化的形成，各种代谢性疾病如糖尿病、终末期肾病发生、动脉血管钙化的发生率也伴随着增加。研究表明，血管钙化是与心血管疾病密切相关的病理改变，可明显增加各种心血管事件的发生，是心血管疾病致残、致死的主要原因［1］。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMCs）在某种因素的作用下由肌细胞表型转变为成骨细胞表型，合成、分泌骨基质等骨相关蛋白参与钙化，是血管钙化的细胞学基础［2］。染料木黄酮（Genistein），是与雌激素作用类似而无副作用的异黄酮类化合物，与雌激素受体结合而发挥其生物学作用。研究发现Genistein可以降低人体多种雌激素依赖型疾病的发病率，在预防肿瘤、心血管疾病、骨质疏松等方面有重要作用［3］。然而，Genistein对VSMCs钙化的研究较少，且机制尚不明确。本文利用体外培养 VSMCs，研究 Genistein对VSMCs钙化的影响及护骨素（osteoprotegerin，OPG）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）等相关因子的变化，期望为抑制血管钙化提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料 SPFBALB／c 小鼠，4 周龄，若干，购于第三军医大学实验动物中心。茜素红、Genistein、羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG二抗购自Sigma公司；蛋白裂解液、BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce；小鼠OPG、α-平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin，a-SMA）、ALP、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）抗体购自Santacruz；聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）引物自上海生工；DMEM细胞培养基、胎牛血清、胰酶购自Gibco；sybrgreen I、逆转录RT试剂、荧光定量PCR试剂购自Western Biotechnology。

1.2 小鼠VSMCs的分离与纯化及模型构建 根据文献方法［4］，获取实验鼠胸主动脉，去除血管外的结缔组织。采用贴块法获取原代VSMCs。0.25%胰蛋白酶消化、传代后用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养。采用免疫组化a-SMA染色进行VSMCs鉴定。实验采用第5～10代细胞。取汇合状态的VSMCs，在含胎牛血清的培养基中 10 mmol／L β-甘油磷酸盐，每两天换液一次，以制备钙化的VSMCs［5］。

1.3 细胞分组 VSMCs钙化培养同时加入相应浓度的Genistein处理细胞，共21 d。分为①对照组；②钙化组；③钙化+Genistein 10 μmol／L 处理组；④钙化 +Genistein 30 μmol／L 处理 组；⑤ 钙 化 +Genistein 50 μmol／L处理组。在预实验中笔者发现不同浓度Genistein对正常VSMCs的影响非常小，因此设立对照组时笔者仅选用30 μmol／L作为代表。

1.4 茜素红染色 培养细胞在2.5%戊二醛中固定20 min后，PBS洗涤三次，加入2%茜素红孵育10 min，丙酮脱水，二甲苯透明。磷酸钙盐沉积染成橘红色。

1.5 荧光相对定量PCR检测 先用试剂盒提取RNA，随后用逆转录聚合酶链反应（reversetranscripition-polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒进行RT-PCR。荧光定量PCR扩增条件的设置：94℃4 min、94℃20 s、60℃30 s、72℃30 s循环 35 次，72℃检测信号。引物序列见表1。设置磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehydes phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因为内参对照，以 2（-⊿Ct）法分析相关基因表达水平。

表1 荧光相对定量PCR引物序列

1.6 Western Blot检测 提取各组细胞的总蛋白，BCA法测蛋白浓度。SDS-PAGE电泳，转膜，封闭1 h后，加入一抗（OPG、a-SMA、ALP、OPN），4℃孵育过夜；洗膜后加入二抗，室温孵育2 h，洗膜，曝光显影。用UVP凝胶图象处理系统Labworks 4.6软件分析目的条带的灰度值。

1.7 统计学处理 采用SPSS 19.0软件，计量资料以±标准差（±s）表示。组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 原代VSMCs的培养及鉴定 培养的细胞呈多边形或梭形，细胞质丰富，细胞核居中（图1A）。为了证实所得细胞为VSMCs，采用SMC特有的a-SMA进行免疫组化染色，镜下可见培养细胞的胞浆內有大量棕色颗粒，排除是其他内皮细胞或成纤维细胞。细胞染色率超过95%，符合实验要求（图1B）。

图1 VSMCs的培养及鉴定

2.2 不同浓度Genistein对VSMCs钙化的影响 培养2周后，不同组别间VSMCs钙盐沉积茜素红染色区别明显（橘红色范围）。第2组显示VSMCs钙化明显，随着Genistein干预，浓度增高后VSMCs钙化逐渐减少，以 Genistein 50 μmol／L 组最为显著（图 2）。

图2 各组VSMCs钙盐沉积茜素红染色结果

2.3 不同浓度Genistein抑制VSMCs钙化后OPG、a-SMA、ALP、OPN mRNA及蛋白表达 与对照组比较，钙化组OPG基因表达显著减低，经过Genistein处理后，随着Genistein浓度增加，OPG表达逐步增高（P＜0.05）。a-SMA基因的变化规律与OPG类似。然而，ALP和OPN基因在对照组表达最弱，在钙化组表达最高，随着Genistein浓度增加，ALP和OPN 基因表达逐步减弱（图3）（P＜0.05）。

图3 各组间 OPG、a-SMA、ALP、OPN mRNA和蛋白表达水平

3 讨 论

动脉血管的异位钙化与多种老年疾病的发生密切相关，是一种常见病理状态，涉及的发生发展过程相当复杂，与骨或软骨的矿化过程类似。在此过程中，VSMCs在外界因素的刺激下转变为成骨细胞表型从而直接参与钙化的发生。研究表明［6］，在动脉粥样硬化病变过程中位于动脉内膜下的VSMCs及巨噬细胞可分泌骨骼特征性蛋白，促进斑块的形成。同样在血管中膜钙化过程中，VSMCs大量分泌的OPG、MGP等非胶原蛋白呈动态变化，提示其与血管钙化关联紧密。

雌激素对心血管系统具有保护作用，笔者证实雌激素与冠状动脉粥样硬化性心脏病关系密切［7］。VSMCs内含有丰富的雌激素受体，既往研究表明，雌激素能够与VSMCs上的受体结合快速舒张血管，同时抑制 VSMCs增生，发挥抗动脉粥样硬化的作用［8］。Genistein与雌激素作用类似，可以降低人体多种雌激素依赖型疾病的发病率，在预防肿瘤、心血管疾病、骨质疏松等方面有重要作用［9］。近年众多研究表明Genistein对肿瘤细胞，成骨细胞具有调控作用，能否作用于VSMCs尚不明确。在本研究发现，钙化组 VSMCs茜素红染色显著增强，予以Genistein处理后钙化结节染色明显减轻，提示Genistein能够发挥抑制VSMCs向成骨细胞分化的作用，并具有剂量依赖性。这一结果证实Genistein具有与雌激素类似的心血管疾病预防保护作用。然而Genistein与VSMCs上的雌激素受体结合后，通过何种通路减轻钙化有待进一步研究。

OPG是由Simonet对大鼠小肠进行cDNA测试时所发现的一种分泌型蛋白，可抑制破骨细胞分化，增高骨密度。在骨组织，OPG主要由成骨细胞产生；在血管系统，主要由内皮细胞及平滑肌细胞产生，在血管钙化过程中对内皮和平滑肌细胞发挥复杂的自分泌和旁分泌作用，而对血管起保护作用［10］。笔者的前瞻性流行病学研究结果显示：血清中OPG含量与冠心病的发病率密切相关［11］。 研究显示［12］，Genistein通过OPG／RANKL／RANK系统对骨代谢予以调节，可直接或间接刺激成骨细胞表达OPG，抑制RANKL分泌，从而抑制破骨细胞分化，减少骨丢失。然而目前在VSMCs钙化过程中，Genistein是否能调控OPG表达尚未见报道。在本研究中，VSMCs钙化组与对照组比较OPG表达显著降低，Genistein处理组明显能增加VSMCs中OPG mRNA水平和OPG蛋白分泌，并且随着Genistein浓度的提高，促进OPG分泌作用更加显著，提示OPG可能是Genistein抑制VSMCs钙化的关键环节，Genistein与雌激素受体结合后通过 OPG／RANKL／RANK系统来影响 VSMCs钙化的进程。

动脉钙化的过程与骨骼的矿化过程类似，都属于主动调节，因此影响骨骼矿化的因素同样可能作用于血管钙化。本实验中，笔者发现除了OPG基因外，ALP、OPN基因也与VSMCs钙化有联系。VSMCs钙化组与对照组比较ALP、OPN表达显著升高，经过Genistein处理后，ALP、OPN表达明显减弱，与OPG变化一致也呈现剂量依赖性。ALP、OPN均为成骨细胞分化特征性基因，它们的表达水平与VSMCs钙化程度密切相关。既往研究表明，正常VSMCs只能合成少量ALP及OPN，在动脉粥样硬化过程中ALP及OPN表达升高，钙化发生后两者表达会进一步增加。因此笔者相信，动脉钙化是局部多种因素在基因和分子水平相互作用的结果，可能存在多个分子交织的调节网络，除了OPG基因外，还有多种与骨代谢相关基因共同参与了VSMCs钙化过程。

综上所述，Genistein具有缓解VSMCs钙化的作用，OPG信号通路与此作用密切相关，ALP、OPN等骨代谢相关基因也参与其中。这一结果有望为抑制血管钙化提供新的途径。