不同左旋聚乳酸支架微结构对心源干细胞增殖、分化的影响

郑 辉，殷胜利，刘云奇，姜福清

支架的空间结构对干细胞增殖和分化具有重大的影响，在心源干细胞中尤为突出，与心肌的特殊功能特性密切相关，为探索空间微结构对干细胞增殖及分化的影响，本研究探求三种不同微结构：层状结构（layered structure，LS）、球体结构（spherical structure，MS）和纳米纤维结构（nanofiber structure，NS）的左旋聚乳酸（L-polylactic acid，PLLA）支架对心源干细胞增殖、分化的影响，综合评价其效果，为组织工程材料微结构的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料 标准误差（standard deviation，SD）的雄性大鼠（8周龄）1只、三种不同微结构的PLLA支架分别56个、96孔板7个、细胞培养基（dulbecco＇s modified eagle medium，DMEM）培养液、免疫荧光染色剂、种子细胞悬浮液、显微镜、培养箱等。

1.2 方法

1.2.1 心源性干细胞的制备 取SD雄性大鼠（8周龄）1只，通过分离、培养、鉴定，最后得到心源性干细胞。

1.2.2 PLLA空间结构的制备 利用 PLLA制备空间结构，分别为 LS、MS、NS的支架，其截面积均为0.25 cm2，孔隙率≥94%。

1.2.3 细胞培养与实验分组 取第三代培养的心源性干细胞（cardiac stem cells，CSCs）， 以 1×105／ml接种到7个96孔板中，每块板选取中间24孔，分为3组，每组8孔，将消毒备用的三种材料支架置于孔中，加入 DMEM 培养液 100 μl，静置 3～5 min后吸除孔中的DMEM培养液，随后在各支架孔中加入制备好的种子细胞悬浮液120 μl，静置3 min，显微镜下观察。将种植好的支架放入37℃、5%CO2培养箱中培养，每隔24 h更换一次培养液，组间互为对照。

1.2.4 细胞活力检测 采用MTT方法检测细胞在第 24 h，48 h，72 h，96 h，120 h，144 h，168 h 的细胞活力，每组重复测量三次，取平均值。

1.2.5 激光扫描共聚焦显微镜检测 取培养1周的三种微结构材料支架，给以固定、破膜、敷一抗、二抗及DAPI染色后用抗荧光淬灭封片液封胶，行激光扫描共聚焦显微镜检测。结果用confocal应用软件ZEN 2008行免疫荧光强度的分析，间接反应出细胞分化情况分析。

1.2.6 电镜扫描检测 取培养1周的三种微结构材料支架，经固定、干燥、喷金后在扫描电镜下检查。

1.3 统计学方法 实验所得的数据采用SPSS 13.0统计软件进行处理，数值均以±标准差（±s）表示，采用one-way anova分析方法分析数值，检验水准a＝1.0，P＜0.05 认为是有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞的增殖情况 根据MTT实验结果，三种不同微结构的PLLA支架均能促进心源性干细胞的增殖（表1），从第48 h后开始，三种空间微结构之间的增值率明显不同（P＜0.05）。以生长时间为横轴，单位有效接触面积内吸光度的大小为纵轴绘制生长曲线（图1）。在a＝0.10检验水准下，球形检验的P＝0.357，故没有足够的证据可以否认该资料符合重复测量的方差分析条件，方差分析的结果表明，处理效应与时间效应的交互作用无统计学意义（F＝1.678，P＝0.82），处理主效应有统计学意义（F＝108.5，P＜0.001），时间主效应有统计学意义（F＝18.38，P＜0.001），两两比较结果表明：吸光度均数随着培养时间增长而增加，并且相邻时间点的增加差异有统计学意义（P均小于0.001）。

表1 三种不同微结构中干细胞不同时间测得的吸光度（AU，±s）

材料类型 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h 168 h LS 0.041±0.005 0.099±0.027 0.307±0.032 0.666±0.019 0.695±0.012 0.680±0.020 0.681±0.017 MS 0.081±0.007 0.263±0.030 0.706±0.068 1.178±0.037 1.063±0.041 1.138±0.031 1.221±0.014 NS 0.119±0.019 0.368±0.045 1.234±0.173 2.116±0.123 1.762±0.103 2.112±0.075 2.217±0.053

图1 吸光度与时间的关系

2.2 激光扫描共聚焦显微镜结果 通过confocal应用软件，ZEN 2008对激光扫描共聚焦显微镜结果行免疫荧光强度的分析发现，三种微结构材料上的心源性干细胞均有分化的心肌样细胞（图2），其中NS材料结构中的荧光强度最强，其次为MS材料，最后为LS材料，说明心源性干细胞在三种微结构材料上的分化情况，其效果最明显的为NS，其次为MS，最差为LS。

2.3 扫描电子显微镜观察结果 三种不同空间微观结构的支架中，心源性干细胞及分化的心肌样细胞所分泌的细胞外基质均比较丰富（图3）。说明三种材料中的细胞生长和分化情况良好。

图2 免疫荧光强度（×200）

图3 扫描电镜结果（15 Kv×1000倍）

3 讨 论

心血管疾病的发病率及死亡率不断升高，并出现年轻化的趋势，其中以缺血性心肌病最为常见［1］，严重威胁着人的生存和生活质量。对于缺血性心肌病的治疗主要有内科药物、介入、外科手术及机械支持治疗等，均存在一定的缺陷及不足［2］。随着干细胞组织工程学的快速发展，为缺血性心肌病的治疗带来了新的希望［3］。

心脏组织工程通常应用于疾病建模和药物筛选［4］，其最终目的在于构建出有生物功能活性的特异性心肌组织。心源性干细胞具有自我更新、克隆形成、多种分化潜能，并能在体内外分化成心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞，具有定向分化心脏细胞系的趋势，具有治疗缺血性心肌病的潜能［5-6］。影响心源性干细胞的增殖和分化因素包括：基因特性、培养条件及周围生存环境及材料支架性质［7-9］。其中材料支架固有特性可以影响组织工程心肌细胞的性能，如：细胞附着、肥大及双核化，离子通道的重塑，心钠素的释放，生物力学应力及结构重构等［10］。至今相关研究表明材料支架的整体宏观和微观孔隙度以及表面化学修饰均可诱导干细胞的定向分化［11-12］，但是不同空间微结构的支架对干细胞增殖及定向分化的方面暂无比较性研究。本研究探索支架微结构对心源性干细胞的影响，筛选性能较好的空间微结构，促进心脏组织的发展。

本次实验中的实验条件除材料的空间微结构外，其余的所有条件基本相似，即实验中唯一的变量为不同的空间微结构，空间微结构不同而使细胞的有效接触面积不同。NS材料中的细胞有效接触面积及细胞增殖空间均少于其他两种，但该结构促进细胞的增殖的效果较其他两种材料好。通过免疫荧光染色在共聚焦显微镜下均可观察到三种微结构材料上的心源性干细胞向心肌样细胞分化，支架微结构促进心源性干细胞向心肌样细胞分化，其效果最明显的为NS，其次为MS。细胞外基质促进细胞的生存及改善细胞的生长微环境，有利于干细胞的生存、生长及分化，本实验中观察到丰富的胞外基质，说明支架结构能促进心源性干细胞增殖分化并能促进其细胞外基质的分泌。结合实验结果，对比三种支架微结构的优劣，在PLLA的NS，MS，LS三种结构中，NS可作为心肌组织工程优先选择的结构之一。

本次实验中仍存在一定的不足，对于细胞增殖及分化的比例、最终分化的组织细胞情况、细胞功能结构、支架性能及降解情况等需要进一步深入研究。