内毒素对妊娠小鼠子宫内巨噬细胞的影响

王婷婷 胡萍 张顺利

摘要：研究了内毒素对妊娠小鼠子宫内巨噬细胞的数量和分布的影响，以探讨巨噬细胞对胚胎的着床和维持的作用。采用昆明系妊娠小鼠分为对照组和试验组，在小鼠妊娠6 d（D6）对照组腹腔注射生理盐水，试验组分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，分别注射1、2、4 μg剂量的内毒素，用酶组织化学染色的方法显示出子宫内巨噬细胞的数量和分布。结果显示，与对照组相比较，试验Ⅰ、Ⅲ组子宫内巨噬细胞的数量明显增多，差异极显著，而试验Ⅱ组与对照组没有显著差异。巨噬细胞在子宫环肌外层、环肌内层和内膜上的分布与对照组相比较，环肌外层巨噬细胞数量减少，而环肌内层和内膜的巨噬细胞数量明显增多，差异显著。提示内毒素使妊娠小鼠子宫内巨噬细胞数量增多，细胞向子宫内膜迁移，而不利于胚胎着床和维持，可能对母胎免疫耐受产生影响。

关键词：内毒素;妊娠小鼠;酶组织化学;巨噬细胞;免疫耐受

中图分类号：S852.2   文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）17-0193-03

妊娠是一个复杂的生理过程，从免疫学上来看类似于器官移植。胚胎对母体来说是一个移植物，母体免疫系统对此进行识别，并产生免疫应答[1]。巨噬细胞是子宫内的一种重要免疫细胞，有多种表面标志和标记酶，具有抗感染、抗肿瘤、呈递抗原和免疫调节等作用。巨噬细胞的数量和在子宫内的分布在胚胎的着床和维持中起到一定的作用[2-3]。

内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁上的一种脂多糖和微量蛋白的复合物，可刺激机体对多糖成分产生抗体[4]。内毒素作为外源性致热原（热原质），作用于中性白细胞、单核细胞、巨噬细胞等。内毒素能够激活妊娠小鼠子宫内的巨噬细胞，从而对胚胎的着床和维持产生影响[5]，也对母胎免疫耐受产生一定的影响。

本试验通过给妊娠期小鼠注射不同剂量的内毒素，通过酶组织化学染色方法，研究内毒素对妊娠小鼠子宫内巨噬细胞的影响，探讨巨噬细胞在胚胎的着床和维持中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物[6] 成年雌性昆明种小鼠40只，由河南师范大学生命科学学院实验动物繁育中心提供，体质量（25±2） g，自由饮水取食。分成对照组与试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，雌、雄鼠按2 ∶ 1合笼，次日晨查见阴栓者为妊娠1 d，到妊娠6 d（D6）时，对照组腹腔注射生理盐水，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别注射 1、2、4 μg剂量的内毒素，8 d（D8）观察流产情况并取材。

1.1.2 主要化学药品和试剂 内毒素，购自Sigma公司;α-醋酸萘酯（α-NAE），购自上海试剂一厂;固蓝B盐购自德国Chroma-gesellschaft公司;其他试剂均为分析纯。

1.1.3 主要仪器 冰冻切片机（美国Reichert Histo Stat Microtome Cryostat），柯达DC 290数码相机。

1.2 方法

1.2.1 小鼠子宫材料的获取 小鼠脱颈椎处死，沿腹中线剪开腹腔，取其子宫，在预冷的生理盐水中快速去除脂肪，迅速放入液氮中冷冻30 s。标记好材料放入-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2 冰冻切片的制备 -20 ℃下冰水包埋材料，修块，切片，切片的厚度8 μm，材料平铺在载玻片上，凉干后-20 ℃冰箱冷冻保藏。

1.2.3 0.2 mol/L PBS盐溶液配制 A液：NaH2PO4·2H2O 3.12 g加100 mL蒸餾水;B液：Na2HPO4·12H2O 7.16 g加100 mL蒸馏水;取A液13 mL加B液87 mL，混合均匀，调pH值至7.4。

1.2.4 孵育液配制 0.03 g α-醋酸萘酯+5 mL丙酮充分溶解+5 mL蒸馏水混匀+20 mL PBS盐溶液（要边加边摇晃防止生成沉淀）+固蓝B盐。充分搅拌溶解混匀。注意孵育液要即配即用。

1.2.5 酶组织化学染色 （1）把冰冻切片室温下充分干燥。（2）放入纯丙酮液中固定10 min。（3）取出固定好的切片用0.2 mol/L的PBS盐溶液冲洗3次，每次5 min。（4）把冲洗好的切片放入配制好的孵育液中，37 ℃温浴锅孵育50 min。（5）从孵育液中取出切片，用0.2 mol/L PBS盐溶液冲洗1次，5 min。放入0.2 mol/L PBS盐溶液中浸泡5 min，再放入蒸馏水中浸泡2 min，取出后甘油明胶封片。（6）镜检、拍照、统计分析。

1.2.6 统计方法 采用χ2检验，α=0.05，结果大于α差异不显著，小于α差异显著。2 结果与分析

2.1 酶组织化学染色巨噬细胞的结果

镜检观察子宫内巨噬细胞，发现巨噬细胞多为不规则形状，也有呈椭圆形、圆形的，染色结果细胞质呈紫色，而细胞核为无色（图1）。

2.2 内毒素对妊娠小鼠胚胎着床的影响

正常小鼠的胚胎为粉红色，透明度较高。注射内毒素后能诱使胚胎流产，先出现阴道出血，然后出现胚胎吸收。对照组未观察到流产，胚胎为粉红色;试验Ⅰ组小鼠未见流产，但发现子宫内有黑红色的瘀血;试验Ⅱ、Ⅲ组流产率分别为75%和100%，胚胎已经模糊不清，出现吸收现象（表1）。

2.3 内毒素对妊娠小鼠子宫内巨噬细胞数量的影响

注射不同剂量的内毒素使妊娠小鼠子宫内巨噬细胞的总数呈波动性变化，注射1 μg内毒素巨噬细胞数量较正常对照组明显增加，2 μg时数量又下降到正常水平，4 μg时数量又增加（图2）。

妊娠小鼠子宫内巨噬细胞的总体数量变化，试验Ⅰ、Ⅲ组与对照组相比差异极显著，而试验Ⅱ组与对照组相比差异不显著（表2）。

2.4 内毒素对妊娠小鼠子宫内巨噬细胞分布的影响

妊娠小鼠子宫内膜巨噬细胞数量分布的变化，试验Ⅰ、Ⅲ组与对照组相比差异极显著，而试验Ⅱ组与对照组相比差异不显著（表3）。

妊娠小鼠子宮内环肌层巨噬细胞的数量分布变化，试验Ⅰ、Ⅲ组与对照组相比差异极显著，而试验Ⅱ组与对照组相比差异显著（表4）。

妊娠小鼠子宫内环肌外层巨噬细胞的数量分布变化，试验Ⅰ、Ⅲ组与对照组相比差异极显著，而试验Ⅱ组与对照组相比差异显著（表5）。

注射不同剂量的内毒素使妊娠小鼠子宫内巨噬细胞的数量分布发生变化。随着注射内毒素剂量的逐渐增加，环肌内层和内膜的细胞数量增加， 环肌外层细胞数量减少。正常情况下，巨噬细胞大多数分布于子宫外膜，注射内毒素刺激环肌内层和内膜的巨噬细胞数量增加。虽然试验Ⅱ组妊娠小鼠子宫内巨噬细胞总数量没有变化，但巨噬细胞在子宫内的分布与对照组相比环肌内层的数量明显增多（图3）。

3 讨论

文献报道非特异性酯酶α-NAE存在于单核细胞、粒细胞系统中，而子宫内的其他细胞几乎不含此物质[7]，本研究观察子宫内巨噬细胞，发现巨噬细胞多为不规则形状，也有呈椭圆形、梭形。α-NAE主要存在于巨噬细胞的细胞质内，染色结果细胞质呈紫色，而细胞核为无色。用此方法可以很简便很快速地显示阳性巨噬细胞，与组化染色相比很经济，但也有一定的缺点，比如染色很容易褪色、不易长时间保存。

有文献报道在妊娠期D8肌层中几乎没有巨噬细胞[8]，本研究也观察到相同的结果，所以在对巨噬细胞进行统计计数时把子宫结构分为环肌外层、环肌内层和内膜进行统计分析。

研究发现，1 μg内毒素能使小鼠巨噬细胞数量增加，使小鼠子宫内膜、肌层的巨噬细胞都与对照有显著性差异，但是随着内毒素剂量的增加，到2 μg时，子宫总的巨噬细胞基本没有变化，但是肌层巨噬细胞和对照相比有了显著性差异。4 μg 时，全部的孕鼠均发生了流产，但总的子宫巨噬细胞数量和1 μg没有显著性差异。但是同样，流产小鼠子宫内膜和肌层的巨噬细胞都与对照有显著性差异。由此，推测子宫内巨噬细胞数量的多少和LPS的用量有关。在一定的LPS范围内，巨噬细胞的数量随LPS剂量增加而减少到一定水平，但是当LPS量继续增大时，巨噬细胞的数量将会增多。

小鼠在正常妊娠期间子宫内巨噬细胞的数量分布随时间不断地发生动态变化，在小鼠妊娠D8子宫内的巨噬细胞主要集中在子宫的环肌外层，而环肌内层和内膜中几乎没有巨噬细胞，有利于胚胎着床和维持。妊娠期子宫内巨噬细胞过多存在对于妊娠不利[9]。本研究也观察到了这种现象，但是试验还观察到了2 μg剂量巨噬细胞总数基本没有变化，但是在子宫内部的分布却发生了变化，也就是说巨噬细胞在子宫内发生了迁移，从而导致流产。

但内毒素是如何调节巨噬细胞的迁移呢？试验组与对照组相比巨噬细胞的数量明显增加，而且巨噬细胞在子宫环肌内层和内膜的分布数量也明显增加，试验Ⅱ组虽然巨噬细胞数量又降到正常的水平，但巨噬细胞分布在环肌内层的数量也明显增加。

内毒素并不干扰孕鼠的正常内分泌功能，也不能穿越胎盘进入胎儿体内。内毒素诱导流产的一个重要机制是引起预致敏的（primed）巨噬细胞释放TNF-α[10-12]。TNF-α导致流产已被动物试验所证实，内毒素诱导小鼠流产与子宫内TNF-α的产生有直接关系，本试验中内毒素能诱导巨噬细胞由子宫外膜向子宫内膜发生迁移，使子宫内膜巨噬细胞数量增加，推测迁移到内膜的巨噬细胞释放TNF-α。它可直接引起胎盘滋养层细胞的凋亡，因滋养层前祖细胞在未成熟阶段发生程序性死亡而耗竭，导致子宫内胎儿缺乏营养而死亡[13]。使妊娠小鼠子宫内的胚胎不能正常着床和维持，可能不利于母胎免疫耐受，使母鼠对胚胎产生排斥而流产，所以内毒素能激活巨噬细胞，使巨噬细胞数量增加，并诱导巨噬细胞向子宫内发生迁移，影响胚胎的着床和维持，导致妊娠小鼠流产。

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