荸荠多酚氧化酶基因的克隆及其在鲜切荸荠贮藏过程中的表达分析

宋慕波 帅良 方方

摘要：利用RACE技术首次从荸荠中克隆得到PPO基因全长cDNA序列，并分析其在鲜切荸荠贮藏过程中的表达变化。克隆得到的荸荠PPO基因cDNA序列全长为2 006 bp，开放阅读框长度为1 734 bp，编码577个氨基酸，命名为CwPPO（登录号：MG702489）。预测分析表明，CwPPO编码蛋白质的分子量为64.86 ku，分子式为C2891H4417N795O873S18，理论等电点为6.50，属亲水性蛋白。CwPPO蛋白可能定位于线粒体基质空间，具有3个典型的保守结构域和2个铜离子结合域。此外，预测发现CwPPO有20个丝氨酸磷酸化位点、7个苏氨酸磷酸化位点及6个酪氨酸磷酸化位点，其二级结构以不规则卷曲为主。系统发育分析显示，CwPPO蛋白与菠萝、油棕有较近的亲缘关系。荧光定量分析发现，CwPPO在鲜切荸荠中的初始表达水平较低，但在贮藏后期表达量快速提高。

关键词：鲜切荸荠;多酚氧化酶;基因克隆;表达分析

中图分类号： TS255.3  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）17-0046-04

荸荠（Eleocharis tuberosa）别称马蹄、地栗，属莎草科多年生浅水草本植物，其球茎风味独特并有较高的药用价值[1]。随着中国经济的发展，鲜切果蔬产品越来越受到消费者的喜爱。荸荠洗净和削皮不易，残留果肉的表皮寄生病菌容易进入人体而引发疾病，加之一般荸荠加工产品难以保持荸荠口感爽脆、清甜可口的特点，因此，卫生和方便的鲜切荸荠产品有较好的市场前景。然而，鲜切荸荠保鲜难度大、货架期短，特别是色泽劣变问题严重影响了鲜切荸荠产业的持续健康发展[2]。

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，简称PPO）是植物体内普遍存在的一种末端氧化酶，可催化酚类物质氧化，形成黑色高聚物，其在果蔬褐变过程中起到的关键作用已经在苹果、梨和姜等果蔬的研究中得到证实[3-5]。一些研究表明，鲜切荸荠表面黄化可能与PPO活性相关，例如，壳聚糖、柠檬酸和水杨酸处理在抑制PPO活性上升的同时改善了鲜切荸荠的黄化[6-8]。然而，Pan等研究发现，导致荸荠黄化的物质是柚皮素和圣草酚而不是PPO参与的氧化反应产物[9]。因此，PPO在鲜切荸荠黄化过程中的作用仍不明确。

由于PPO是参与果蔬褐变的关键酶，其编码基因已在菠萝、甘薯、茶树、香蕉等多种植物中克隆得到[10-12]。荸荠分子生物学方面的研究较少，关于荸荠PPO基因的克隆和相关分子生物学研究未見报道。鉴于此，本研究拟利用前期获得的荸荠转录组数据进行荸荠果肉的PPO基因全长cDNA的克隆，研究鲜切荸荠贮藏过程中PPO基因的表达变化，可为多酚氧化酶的研究、鲜切荸荠黄化机制研究以及完善鲜切荸荠贮藏方案提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料及处理

荸荠（Eleocharis tuberosa）于2016年12月10日购自广西壮族自治区贺州市八步区农产品市场。购买后运回实验室清洗，挑选大小均一和无机械损伤、无病虫害的荸荠，去皮后横切成厚度为0.5 cm的圆片，然后用0.1%（w/V）次氯酸钠溶液杀菌10 min，将样品晾干后置于塑料托盘中用0.02 mm聚乙烯保鲜膜包装，于10 ℃下贮藏。

1.2 试剂

植物RNA提取试剂盒，华越洋生物科技（北京）有限公司;SMARTer RACE 5′/3′ Kit RACE试剂盒、LA Taq DNA聚合酶、PMD-19T载体、感受态细胞DH5α、感受态细胞Stellar、DNA Marker、SYBR Green qPCR Master Mix荧光定量酶、6×Loading buffer、PrimeScriptTM RT reagent Kit反转录去基因组试剂盒，日本TaKaRa公司;溴化乙锭，生工生物工程（上海）股份有限公司;DNA凝胶回收试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司;琼脂糖，西班牙Biowest公司;Tris、乙醇、EDTA-Na2均为分析纯，国药集团药业股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 荸荠果肉总RNA提取 采用华越洋植物RNA提取试剂盒提取荸荠果肉总RNA，具体方法按照说明书进行。得到RNA后利用K5600超微量分光光度计测定其纯度和含量，RNA样品保存于-80 ℃超低温冰箱中，用于反转录等后续试验。

1.3.2 荸荠果肉PPO基因克隆 3′RACE-cDNA和5′RACE-cDNA的合成具体操作按照SMARTer RACE 5′/3′ Kit RACE试剂盒进行。根据之前从荸荠转录组数据中得到的PPO基因片段设计3′RACE和5′RACE引物（表1）。PCR反应程序：94 ℃预变性1.5 min;94 ℃变性30 s，68 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，25个循环;72 ℃延伸10 min，产物于4 ℃保存。PCR产物经回收、连接（pRACE vector）、转化（Stellar感受态细胞）、重组子筛选及菌液PCR鉴定后，测序委托华大基因科技股份有限公司进行。应用DNAMAN软件和NCBI在线工具对荸荠PPO基因进行序列基本结构和特征分析。

根据拼接得到的基因全长核苷酸序列设计引物（表1）。以反转录cDNA为模板，进行PCR扩增，经检测和测序获得全长序列。

1.3.3 荸荠PPO基因生物信息学分析 采用NCBI中的BLASTN、BLASTP程序进行核苷酸序列及其推导的氨基酸序列的同源性比较;ORF Finder程序寻找开放阅读框;采用ProtParam Tool分析蛋白质理化性质;采用Conserved Domains分析氨基酸序列的保守区域;采用Post Prediction和SubLocv 1.0进行蛋白亚细胞定位信号预测;ProtScale以Hphob./Kyte & Doolittle算法进行亲疏水性预测;使用NetPhos 2.0 Server预测蛋白质序列的磷酸化位点;使用ExPaSy-SOPMA软件分析蛋白质的二级结构;使用Clustal X2软件进行多重序列比对;采用Mega 5软件进行系统进化树构建;采用SWISS-MODEL预测蛋白质三级结构;采用Swiss-PdbViewer构建蛋白模型的拉氏构象图。

1.3.4  荸荠PPO基因的表达分析 根据获得的荸荠PPO基因cDNA序列利用Primer 5.0设计Q-PCR特异引物（表1）。采用PrimeScriptTM RT reagent Kit去除基因组和反转录试剂盒合成Q-PCR的模板cDNA，操作方法見说明书。参考TaKaRa公司的SYBR Green qPCR Master Mix说明书进行 Real-time PCR扩增。以18S rRNA（登录号：MG742686）为内参。利用2-ΔΔCt方法计算鲜切荸荠PPO基因在贮藏过程中的表达量。各样品的表达量均为3次生物重复的平均值。

2 结果与分析

2.1 荸荠果肉PPO基因cDNA全长序列克隆

荸荠转录组测序筛选得到与其他植物PPO基因同源性较高的基因片段，利用NCBI的BLAST程序进行比对，结果显示，与其他植物的PPO基因核苷酸序列相似度为62%～73%，其中与菠萝（Ananas comosus，XM_020246795.1）PPO基因核苷酸序列相似性最高，为73%。根据该序列设计3′RACE和5′RACE引物，进行PCR获得3′和5′端序列分别约为1 700 bp和600 bp（图1-A，图1-B）。将片段回收后进行测序分析发现3′端序列长度为1 663 bp，包含了3′非翻译区（3′UTR）及poly A结构;5′端序列长度为547 bp，包含了5′非翻译区（5′UTR）。将3′和5′端序列拼接后得到基因全长序列，在拼接序列的5′端和3′端设计引物扩增PPO的cDNA全长序列（图1-C），测序结果显示，该序列与拼接结果一致。

将克隆得到的全长序列使用NCBI中ORF Finder软件进行分析。该序列长度为2 006 bp，含有1个1 734 bp的最大开放阅读框（ORF）、57 bp的5′UTR区、188 bp的3′UTR区及27 bp的polyA结构，起始密码子ATG位于第58～60位，终止密码子为TGA（图2）。将该cDNA序列在NCBI上进行比对，发现该序列与油棕（Elaeis guineensis;XM_010912626.2，XM_010928464.2）、海枣（Phoenix dactylifera;XM_008779971.1）和菠萝（Ananas comosus;XM_020246795.1）的PPO基因相似度较高，均大于68%。因此，可证明已经克隆获得荸荠PPO基因，将此基因命名为CwPPO，并在GenBank上登录，登录号为MG702489。

2.2 CwPPO基因生物信息学分析

经预测分析，CwPPO编码蛋白质的分子量为64.86 ku;分子式为C2891H4417N795O873S18;理论等电点为6.50;利用ProtScale软件预测其属于亲水性蛋白，亲水指数（GRAVY）为-0.572。

CwPPO蛋白存在跨膜结构，属于跨膜蛋白，可能存在由内到外或由外到内的双向跨膜的2个跨膜螺旋结构域。采用NCBI的Conserved domains数据库预测CwPPO的保守结构域，发现了3个典型的保守结构域，分别为未知功能的保守结构域（446～575，PPO1_KFDV，pfam12143）及酪氨酸普通中心区域（162～372，Tyrosinase，pfam00264）、多酚氧化酶中间保守域（379～429，PPO1_DWL，pfam12142）（图3）。使用SignalP 3.0和Post Prediction预测显示CwPPO为非分泌蛋白，定位于线粒体基质空间的可能性最大。

蛋白质的磷酸化是最普遍和重要的蛋白翻译后修饰方式。经磷酸化预测发现，CwPPO编码的蛋白可在20个Ser、7个Thr和6个Tyr氨基酸位点进行磷酸化修饰。在这33个磷酸化位点分值最高的是S467，为0.997。磷酸化位点能够影响CwPPO蛋白的分子构象和活性，其位点预测能够为今后基因表达调控，蛋白修饰提供参考。

采用SOPMA软件预测CwPPO蛋白的二级结构，结果显示，该蛋白最主要的结构是无规则卷曲占64.52%，其次α-螺旋占19.83%， 延伸链占15.65%。α-螺旋和延伸链

分散于整个蛋白质中，且N-末端多以无规则卷曲形式存在，C-末端主要为延伸链形式。

利用Swiss-model预测CwPPO蛋白的三级结构，由软件自动匹配模板（PDB No. 4z11.1）进行参照建模，CwPPO蛋白三维结构中的α-螺旋、延伸链和无规则卷曲呈均匀分布，中间有2个铜离子结合域，位于172～202和324～359处（图4）。采用Swiss-Pdb Viewer软件分析上述同源建模结果，通过拉氏构象可以看出蛋白质残基的二面角（ψ和φ）位于核心区域，表明其空间结构稳定，故上述利用同源建模的方法对CwPPO蛋白进行建模的结果较为可靠（图5）。

2.3 CwPPO蛋白序列多重比对和进化树构建

通过与其他植物PPO蛋白比对发现，不同PPO功能区域的氨基酸序列较为保守，而C-端、N-端区域的差异较大，尤其C-端的差异最大。为了解CwPPO蛋白与其他植物PPO蛋白的进化关系，对CwPPO蛋白进行多序列比对并建立系统进化树（图6）。结果发现，CwPPO与油棕（Elaeis guineensis）、菠萝（Ananas comosus）的PPO蛋白亲缘关系较近。

2.4 CwPPO在鲜切荸荠贮藏过程中的表达分析

通过荧光定量PCR分析鲜切荸荠贮藏过程中CwPPO的表达变化。结果表明，荸荠果肉中CwPPO的初始表达水平较低，切分后随着贮藏时间的延长，CwPPO表达水平逐渐升高，与鲜切荸荠的颜色变化表现出一定的相关性（图7）。

3 讨论与结论

多酚氧化酶（PPO）能够氧化植物中的酚类物质形成黑色高聚物，是导致鲜切果蔬褐变的关键酶[13]。其编码基因PPO在多种植物中属于多基因家族，如番茄、马铃薯中都发现了多个不同的编码基因[14-15]。但并非所有植物的PPO都属于多基因家族，例如葡萄藤中仅发现了1个PPO基因[16]。笔者前期在荸荠转录组数据中只发现了1个与其他植物PPO同源性较高的基因片段。本试验克隆得到的荸荠果肉PPO基因序列长度为2 006 bp，编码577个氨基酸，命名为CwPPO。CwPPO蛋白保守结构域预测显示其含有3个典型的保守结构域，这与以往报道的PPO蛋白的保守结构域[17]吻合。植物多酚氧化酶基因序列的2个铜离子结合域的同源性都很高，这是多酚氧化酶的主要功能区[18]。通过对蛋白序列进行保守结构域分析，发现CwPPO基因包含2个含铜的高度保守区（CuA、CuB），在同源构建CwPPO蛋白的三维模型中也可以看到2个铜离子结合域，分别是位于172～202和324～359处，这些功能域是植物PPO的主要功能区。系统进化树分析结果显示，CwPPO编码的氨基酸与油棕（Elaeis guineensis）、菠萝（Ananas comosus）有较近的亲缘关系。

鲜切荸荠10 ℃下贮藏前2 d基本没有颜色变化，之后荸荠表面组织才均匀黄化，与传统酶促褐变相比有明显的“启动”期。同时，贮藏期间荸荠PPO活性也较低，表明荸荠果肉中可能预先并不存在大量的PPO，而且鲜切荸荠贮藏过程中PPO的底物含量也较低[19-20]。因此，研究者推測荸荠的黄化与PPO参与的酶促褐变不同。本研究发现鲜切荸荠贮藏过程中CwPPO的表达水平逐渐升高，与荸荠黄化进程表现出了一定的相关性。切割伤害可以诱导植物PPO表达，增加酶的合成量，从而导致鲜切果蔬和外植体的褐变[21]。随着贮藏时间的延长，荸荠完全黄化后还会出现明显的褐变。因此，PPO可能没有参与荸荠贮藏前期的黄化过程，但贮藏后期逐渐积累的PPO是否参与了鲜切荸荠黄化后的褐变有待进一步研究。

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