基于ITS2的北沙参药材及其伪品的分子鉴定

韩晓伟 曹楸伟 严玉平

摘要：利用内部转录间隔区2（ITS2）条形码来鉴定河北某药材市场北沙参的真伪品，探讨分子方法鉴定北沙参药材真伪品的可行性。提取12份北沙参样品的DNA，利用ITS2引物进行PCR扩增，对扩增产物进行双向测序，利用CodonCode Aligner软件进行序列拼接。从Genbank下载13条北沙参序列，利用MEGA 6.0分析比对25份序列，计算其种间、种内的Kimura双参数遗传距离（K2P距离）以及各序列的变异位点并进行聚类分析，利用RNA多重排列（locARNA）来预测北沙参及其伪品的二级结构。12份样品中10份为北沙参，1份是川明参，1份为祁木香。ITS2序列可以较好地区分北沙参及其伪品，可作为北沙参鉴定的有效方法而加以推广。北沙参的DNA条形码鉴定体系的建立，为DNA条形码技术在临床及市场监管领域的实践应用提供了理论基础。

关键词：北沙参;真伪品;ITS2;DNA条形码;临床用药

中图分类号： R282.710.3  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）17-0071-05

北沙参（Glehnia littoralis）为伞形科珊瑚菜的干燥根，为我国常用大宗中药材之一，临床上主要用于治疗肺燥干咳、热病伤津等症[1]。北沙参主产于河北安国、山东莱阳、内蒙赤峰等地[2]，其中河北安国产北沙参为安国八大祁药之一，以其条粗顺直，无杈无须，被誉为“一柱香”，《神农本草经》列其为上品。北沙参作为药食两用的药材，受到广大消费者喜爱，但是由于市场上常有许多北沙参的混伪品作北沙参来用，因此易产生混淆，从而对临床用药安全造成威胁。

一直以来利用理化性质对北沙参进行鉴定是主要的鉴定方式[3-6]，而DNA条形码鉴定技术的发展为中药材的鉴定提供了新的工具。陈士林等提出以内部转录间隔区2（ITS2）作为药用植物鉴定的通用序列并在中药材鉴定方面进行了大量尝试[7-8]。目前已有利用ITS2对北沙参进行鉴定的报道[9-10]，这些研究主要关注药材原植物的鉴别或原植物与药材的混合鉴别。本研究是利用ITS2的序列，对河北某中药材市场的北沙参药材进行检测，为DNA条形码技术应用于药材市场的监管和临床用药的安全提供理论和实践的基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

12份北沙参药材的样品全部购自河北某药材市场，经河北中医学院郑玉光教授鉴定，凭证样本保存于河北中医学院药学院，其余13个样本来源于GenBank，样品来源见表1。

1.2 试验设计

1.2.1 仪器与试剂 Taq酶[宝日医生物技术（北京）有限公司];PCR仪及凝胶成像系统[伯乐生命医学产品（上海）有限公司];核酸电泳仪（北京六一生物科技有限公司）;离心机（Eppendorf中国）;胶回收试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）;其他均为进口分装或国产分析纯试剂。引物由上海英骏生物技术有限公司合成，测序工作由华大基因完成。

1.2.2 DNA提取、PCR扩增和测序 提取北沙参干燥根的基因组DNA，利用通用引物ITS2对所提取的DNA进行PCR扩增，引物序列如下：

ITS2F：5′-ATGCGATA-CTTGGTGTGAAT-3′;

ITS2R：5′-GACGCTTCTCC-AGACTACAAT-3′。

扩增反应体系为50 μL。反应体系按照韩晓伟等的方法[11]配制，PCR完成后利用1%琼脂糖凝胶电泳检测结果，每份样品30 μL PCR产物直接送深圳华大基因公司北京测序部进行测序。每份样品均进行3次生物学重复。

1.2.3 数据处理 数据处理方法按照韩晓伟等的数据处理方式进行[11]。二级结构预测利用RNA多重排列（locARNA）方式进行。

1.2.4 试验时间和地点 试验时间为2017年，试验地点为河北中医学院橘泉校区科研楼。

2 结果与分析

2.1 北沙参样品DNA提取和PCR扩增结果

提取出12份样品的DNA后，利用ITS2引物进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，12份样品均能扩出单一明亮的条带（图1），随后将扩增的产物测序。

2.2 序列的比对与提交

將扩增的12份样品的ITS2序列经CodonCode Aligner软件校对拼接后，在NCBI网站上进行BLAST比对，结果发现12份样品中有10份为北沙参，1份为川明参，1份是祁木香。重新进行取样，提取DNA后扩增测序，结果相同。这说明北沙参药材中混入了其他品种。将12条序列提交到GenBank数据库并获得了登录号（表1）。

2.3 北沙参样品序列的分析

北沙参样品的ITS2序列长度约为227 bp，在确定的10份北沙参样品中，MG793244有15个变异位点，MG793246和MG793247序列相同，有6个变异位点，说明北沙参存在较明显的种间变异（图2）。而MG793249川明参与北沙参的序列差别较大，表明二者从遗传组成上是有差别的，不可混用。MG793252祁木香的序列与北沙参基本不同。

2.4 北沙参及其混伪品的种内种间遗传距离分析

基于K2P模型计算北沙参与其混伪品的K2P距离，北沙参种内K2P遗传距离平均为0.002，种内最大K2P遗传距离为0.004。北沙参与其混伪品的种间遗传距离最小为0.028，远远大于北沙参的种内最大遗传距离，表明ITS2能够准确区分北沙参及其混伪品（表2）。

2.5 北沙参及其混伪品的聚类分析

基于得到的12条ITS2序列，然后从GenBank下载13条序列，利用邻接法（NJ法）构建系统聚类树。可以看出，MG793241～MG793243、MG793245、MG793248～MG793250共7条序列与GenBank下载的北沙参的序列（KF010586～KF010588）聚为1支。MG793246和MG793247因为与北沙参的种间变异较多而单独聚为1支，MG793244也因为与北沙参的种间变异较多而单独聚为1支，这3个样品的外形与北沙参无异，但因为种间变异数较多，是否会影响到药效，须要作更深一步研究。从GenBank下载的KM191311～KM191315均为轮叶沙参，因此聚为1支，KM191316～KM191320均为沙参，因此聚为1支。祁木香MG793252与川明参聚为1支，说明祁木香与川明参有相似之处（图3）。

2.6 北沙参及其混伪品的二级结构比较

利用locARNA方式对北沙参及其混伪品的ITS2进行二级结构预测，图4表明，北沙参与川明参和轮叶沙参的二级结构存在较大差异，能够很明显的区分。祁木香的主环结构与北沙参相似，但其茎环结构与北沙参相差较大，区别也较明显（图4）。由此可以看出，利用二级结构也能够很好地区别北沙参及其混伪品。

3 讨论与结论

我国中药材资源丰富，种类繁多，但是在药材流通市场上仍然有掺杂使假现象发生。《中国药典》（2015版）中对北沙参的鉴别方法有物理和化学2种方法，但是这2种方法已经不能满足市场对药材鉴别方法的需要[12]。DNA条形码技术的发展为中药材的鉴定提供了全新的技术手段，已经被《中国药典》中部分中药列为药材鉴定的方法之一。本研究说明了利用DNA条形码技术鉴定北沙参药材的可行性。

在利用DNA条形码技术鉴定北沙参药材的过程中，选择了不同产地的北沙参，结果发现河北安国产的北沙参中有种内变异的情况。将发生种内变异的MG793244、MG793246、MG793247 3个样品重新提取DNA，PCR后送测序，结果与先前相同，说明确实发生了种内变异，但该变异属于无害的变异，并未影响到北沙参的性状。

由于对干燥坚硬的北沙参药材进行DNA提取，因此在提取过程中进行了多种方法的试验[13]，通过钢珠振动将北沙参药材研磨得尽量细碎，同时通过延长DNA提取时间使干燥细胞充分裂解，从而提高所得DNA的浓度，保证后续PCR的效果。本试验中的12份样品均可扩增出单一明亮条带，基于K2P距离建立的NJ树以及二级结构的预测都能够很好地将北沙参及其伪品区分开来。12份市场药材中正品10份，伪品1份，祁木香为阴性对照，正品率为83.3%。虽然在12份样品中只有1份川明参，但是因为川明参和北沙参的功效是不同的， 因此，如果误将川明参作北沙参入药，仍会给临床用

药带来隐患。因此，中药材市场仍须净化以保证临床用药安全。

综上所述，DNA条形码技术能够准确地鉴别北沙参及其伪品，本试验所鉴定的12份样品的结果与药材鉴定专家的鉴定结果一致，说明DNA条形码技术是安全、高效的药材鉴定技术，在中药材流通及市场监管中有很大的应用推广价值。

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