吡咯啉-5-羧酸还原酶1在膀胱癌组织中的表达及其临床意义

谢智彬 谢光宇 冯耀宁 黄恒前 翁旋任 付伟金

1广西医科大学第五附属医院泌尿外科（南宁530021）；2广西医科大学第一附属医院泌尿外科（南宁530021）

膀胱癌是泌尿系肿瘤中常见的恶性肿瘤［1-2］，在我国的发病率逐年上升，其发生、发展主要受环境及遗传相关因素的影响，主要分为非浸润型膀胱癌和浸润型膀胱癌［3］，非浸润型膀胱癌主要以经尿道膀胱肿物切除术为主，术后灌注化疗等综合治疗［4-5］。因膀胱癌具有易复发、易转移特性，约30%非浸润型膀胱癌患者复发进展为浸润型膀胱癌，而根治性膀胱切除是浸润型膀胱癌治疗的金标准，术后生存质量以及预后欠佳［6］。随着分子技术的快速发展，分子靶向治疗肿瘤已成为目前研究热点，因此，寻找能准确预测肿瘤的发生以及监测肿瘤进展的分子靶点具有重要意义。

吡咯啉-5-羧酸还原酶1（pyrroline-5-carboxylate reductase 1，PYCR1）是一种参与细胞代谢的活性酶，是脯氨酸生物合成中的最终酶［7-8］。早期主要研究发现人类PYCR1 的突变与皮肤松弛、早衰以及抗氧化应激活、线粒体调节密切相关［9-11］。然而对于其与肿瘤的关系报道相对较少，近年来随着对PYCR1 研究的深入，发现其在多种实体肿瘤中异常表达［8，12-13］，但在膀胱癌中的表达情况目前尚未明确，故本研究探讨PYCR1 在膀胱癌患者中的表达情况及其临床意义，为临床治疗及未来精准靶向药物治疗膀胱癌提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2015年10月至2018年1月广西医科大学第一附属医院经手术切除的初诊膀胱癌患者43 例，其中男30 例，女13 例，平均年龄64.3（45～78）岁，低级别14 例，高级别29 例。所有患者术前均未接受放疗、化疗或生物等治疗，术后经病理检查证实为膀胱癌，术中均留取膀胱癌组织及癌旁组织。所有标本均在离体后30 min 内放置-80 ℃冰箱中保存。下载癌症基因图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库（https：//cancergenome.nih.gov/）中膀胱癌表达PYCR1 相关的RNA-Seq 数据和匹配的临床数据资料，共入426 例膀胱癌样本，其中癌与癌旁组织配对19 例。所有标本均经医院伦理委员会同意，并与患者家属签署相关知情同意书。

1.2 膀胱癌和癌旁组织中PYCR1 mRNA 表达检测采用实时荧光定量PCR 技术（real time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测PYCR1 mRNA 表达。具体步骤：采用mRNA 提取试剂盒（Sigma 公司）按照说明书步骤在低温环境下提取标本总mRNA，采用分光光度仪的OD260/OD280评估所提取的mRNA 的质量，并计算mRNA 浓度。根据mRNA 浓度按逆转录试剂盒（Takara 公司）要求稀释配比后逆转录成cDNA，然后采用RT-PCR扩增膀胱癌及癌旁组织中PYCR1 mRNA 表达。PYCR1 引物及内参β-actin 均由武汉金开瑞生物工程有限公司设计并合成。PYCR1 引物上游5′-GAAGATGGGGGTGAAGTTGA - 3′ ，下 游5′ - CTCAATGGAGCTGATGGTGA-3′；β-actin 引物上游5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，下游5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。反应条件：95 ℃预变性2 min、94 ℃变性20 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸30 s，共40 个循环。所有试验均独立重复3 次。

1.3 膀胱癌及癌旁组织中PYCR1蛋白检测采用SP 免疫组化染色法。兔抗人PYCR1 购自Abcam公司，免疫组化SP 试剂盒和DAB 显色试剂盒均购买于北京中杉金桥公司。收集膀胱癌及癌旁手术标本经10%甲醛固定24 ～48 h，常规石蜡包埋，4 μm 连续切片，采用0.01 mmol/L 枸橼酸缓冲液抗原修复，室温自然冷却，加入内源性过氧化酶阻断剂10 min，PBS 冲洗3 次，分别加入单抗，4 ℃恒温箱孵育过夜，PBS 液冲洗3 次，加二氨基联苯胺四盐酸显色。最后由两位高年资病理科医生行双盲在显微镜下对结果进行判断，PYCR1 阳性染色定位于细胞质，呈棕黄色细颗粒状。按染色的强度的深浅评分：0 分无染色；1 分淡黄色；2 分棕黄色；3 分棕褐色。按阳性细胞百分比评分：1 分：1%～10%；2 分：10%～50%；3 分：50%～80%；4 分：＞80%，接着按染色强弱与阳性细胞的乘积积分，≥4 分为阳性。

1.4 统计学方法采用SPSS 23.0 软件进行分析，计量数据以（）表示，计量资料组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PYCR1 在TCGA 数据库中膀胱癌的表达情况结果发现TCGA 数据库中总体407 例膀胱癌样本中的癌和19 例癌旁组织PYCR1 的mRNA 表达水平分别为（9.984±1.614）和（7.529±1.087），差异具有统计学意义（P＜0.001），同时配对的19 对膀胱癌患者和癌旁组织的PYCR1 的mRNA 表达水平分别为（10.166±1.073）和（7.529±1.087），同样差异有统计学意义（P＜0.001）。而PYCR1 的mRNA表达水平与TCGA 总样本的临床病理特征的关系详见表1，发现PYCR1 高表达与年龄（χ2= 9.064，P=0.003）、病理分级（χ2=18.133，P＜0.001）、N 分期（χ2= 13.439，P＜0.001）、T 分期（χ2= 4.681，P=0.03）和M 分期（χ2= 5.569，P= 0.018）、临床分期（χ2= 14.303，P＜0.001）有关，但与性别不相关（P＞0.05）。见表1。

2.2 膀胱癌和癌旁组织中PYCR1 mRNA 表达比较本研究收集的膀胱癌与癌旁组织中PYCR1 mRNA 表达量分别为（5.81 ± 1.46）、（4.93 ± 1.37），差异具有统计学意义（P＜0.05），同时发现膀胱癌患者的PYCR1 mRNA 表达的与临床分期及淋巴结转移相关，差异具有统计学意义（均P＜0.01），认为有淋巴结转移和晚期的膀胱癌患者的PYCR1 mRNA 表达量较无淋巴结转移和早期的膀胱癌患者高，但与患者的性别、年龄、病理分级、远处转移均未发现有关联，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表1 TCGA 数据库中膀胱癌样本的PYCR1 mRNA 表达水平与临床病理特征的关系Tab.1 Relationship between PYCR1 mRNA expression and clinicopathological features in bladder cancer samples from TCGA database 例

2.3 膀胱癌和癌旁组织中PYCR1 蛋白表达情况免疫组化结果示，PYCR1 阳性染色主要定位在细胞核内，呈现黄色或棕黄色颗粒状。见图1～4。PYCR1 蛋白在膀胱癌组织中表达阳性率为58.14%，在癌旁组织中表达的阳性率为16.28%（χ2=16.125，P＜0.001），说明膀胱癌组织中PYCR1蛋白的表达明显高于癌旁组织。分析PYCR1 的表达与膀胱癌临床病理特征的关系发现，膀胱癌患者癌组织PYCR1 蛋白表达的升高与临床分期（χ2= 4.341，P= 0.037）及淋巴结转移（χ2= 4.838，P= 0.028）相关，PYCR1 蛋白在淋巴结转移膀胱癌中阳性率高于无淋巴结转移膀胱癌（90.9%vs.46.9%，P＜0.05）；PYCR1 蛋白在临床分期T2～T4期膀胱癌中的阳性率高于Ta～T1 期膀胱癌的阳性率（83.3%vs.48.4%，P＜0.05），但与患者的性别、年龄、病理分级、远处转移均无关（P＞0.05）。见表2。

图1 膀胱癌组织的HE 染色图（×100）Fig.1 HE staining of bladder cancer tissue（×100）

图2 癌旁膀胱组织的HE 染色图（×100）Fig.2 HE staining of paracancerous bladder tissue（×100）

图3 PYCR1 在膀胱癌组织的表达（×100）Fig.3 Expression of PYCR1 in bladder cancer tissues（×100）

图4 PYCR1 在癌旁膀胱组织的表达（×100）Fig.4 Expression of PYCR1 in adjacent bladder tissues（×100）

表2 PYCR1 的表达量与膀胱癌患者临床病理特征关系Tab.2 Relationship between expression of PYCR1 and clinicopathological features of bladder cancer patients

3 讨论

膀胱癌是泌尿系疾病中常见的肿瘤，具有发病率高、临床治疗疗效及患者预后较差的特性，但其发生发展及转移是一个复杂的过程，其中可能涉及许多肿瘤相关因子的参与和调控。因此，如何进一步探究膀胱癌发生、发展的分子机制，寻找可靠的生物标志物以及有效的分子治疗靶点对提高膀胱癌患者诊断及预后意义重要。

PYCR1 是一种代谢相关的酶，在脯氨酸生物合成中起关键作用，是脯氨酸生物合成中的最终酶，其作用是催化NAD（P）H 依赖性还原吡咯啉-5-羧酸酯生成脯氨酸。早期主要研究发现人类PYCR1 的突变与皮肤松弛、早衰以及抗氧化应激活、线粒体调节密切相关。而对于其与肿瘤的关系目前报道相对较少，研究表明PYCR1 与肺癌、前列腺癌、乳腺癌等发生、进展存在密切联系。CAI 等［12］研究发现PYCR1 在非小细胞肺癌中呈现高表达，且与患者的预后密切相关，证实高表达PYCR1 的肺癌患者相关性总生存时间明显差于PYCR1 低表达患者，通过沉默PYCR1 后，肺癌细胞株的增殖能力明显受到抑制，并诱导肺癌细胞凋亡，认为PYCR1 可作为抑制肺癌细胞增殖的新型治疗靶标。DING 等［8］研究发现PYCR1 在mRNA和蛋白水平与乳腺癌患者肿瘤的大小、临床分级以及分型密切相关，同时发现高表达PYCR1 的患者的生存预后明显较低表达的患者差，使用RNA干扰抑制PYCR1 表达后，乳腺癌细胞的生长及侵袭能力明显下降，同时增强了多柔比星在乳腺癌细胞株中的细胞毒性，认为PYCR1 可作为乳腺癌治疗的潜在靶点。在泌尿系肿瘤中情况，ZENG等［13］研究发现PYCR1 在前列腺癌组织中呈高表达，并其表达量与前列腺癌患者的年龄、Gleason评分相关，通过慢病毒介导敲除前列腺癌细胞株DU145、PC-3、LNCap 后，癌细胞的增殖及集落形成能力明显下降，其原因可能是增强细胞凋亡和G2/M 期阻滞，同时发现凋亡相关蛋白显著增加，认为PYCR1可能作为治疗前列腺癌良好的潜在靶点。然而PYCR1 在膀胱癌的表达情况目前尚未明确，故本研究通过结合TCGA 数据库及收集43 例膀胱癌患者的癌组织和癌旁组织中mRNA 和蛋白水平表达情况，探讨PYCR1 在膀胱癌患者的表达情况以及与患者临床特征间的关系，为临床治疗及未来精准靶向药物治疗膀胱癌患者提供进一步的基础研究依据。

本研究结果发现，首先通过TCGA 数据库分析表明膀胱癌组织中PYCR1 的mRNA 表达水平显著高于癌旁组织，并且发现PYCR1 高表达与年龄、病理分级、N 分期、T 分期和M 分期、临床分期密切相关。同时本研究通过qRT-PCR 技术证实膀胱癌组织中PYCR1 mRNA 的相对表达量明显高于癌旁组织，与TCGA 数据库结果相一致，免疫组化实验还发现膀胱癌组织中的PYCR1 蛋白的阳性率显著高于癌旁组织，说明膀胱癌组织中PYCR1 基因mRNA 和蛋白的表达水平显著升高。同时，通过分析PYCR1 的表达与膀胱癌临床病理特征的关系发现，膀胱癌患者癌组织PYCR1 蛋白表达的升高与临床分期及淋巴结转移相关，认为PYCR1 蛋白在淋巴结转移膀胱癌中阳性率高于无淋巴结转移膀胱癌；PYCR1 蛋白在临床分期T2-T4 期膀胱癌中的阳性率高于Ta～T1 期膀胱癌的阳性率，但与患者的性别、年龄、病理分级、远处转移均未发现有关联，与PYCR1 在mRNA 表达水平得出的结论相一致。但其确切的机制目前尚未明确，故笔者拟建立过表达及沉默PYCR1 的膀胱癌细胞株模型，探讨其参与膀胱癌的发生发展的机制研究。

综上所述，本研究结果发现PYCR1 在膀胱癌中呈现高表达，并与膀胱癌患者的临床病理特征具有一定的相关性，提示PYCR1 可能参与了膀胱癌的发生、发展，为膀胱癌的基因靶向治疗提供一个新的思路。