物理混合藏耗牛酥油制备母乳替代脂

陈桢隆 叶玉兰 朱雪梅 胡蒋宁 熊 华 阮 征

（南昌大学食品学院 食品科学与技术国家重点实验室 南昌 330047）

藏耗牛酥油（简称酥油，俗称醍醐），是藏族人民日常生活中的一种主要食品，它是从藏耗牛牛乳中通过油水分离提炼来的一种手工制精炼酥油，深受牧民喜爱[1-2]。在蒙古地区，酥油很早以前就已应用于军队的长途征战中[3]。每100 g酥油含热量860 J左右，其熔点约为40℃，因此有机体能从中获取充足的能量[1，4]。以酥油为食的藏族和喜马拉雅山脉地区人民有较好的身体素质[5]。有研究表明[6]由酥油制备的滋补酥油颗粒具有补肾益智、光泽皮肤的功效，在临床上安全可靠。酥油还具有治疗老年人习惯性便秘的功能[7]。目前藏牦牛酥油主要用来制备微胶囊粉末，生产酥油茶等产品，或直接作为食材食用[8-12]。国内外学者[13-20]对酥油脂肪酸组成分析结果表明，酥油中含90%以上的甘油三酯，其中饱和脂肪酸中棕榈酸（C16：0）、硬脂酸（C18：0）含量较高，还含有少量月桂酸（C12：0）、肉豆蔻酸（C14：0）、癸酸、辛酸等饱和中链脂肪酸；油酸接近不饱和脂肪酸的90%，在不饱和脂肪酸中含量最高；另一方面，如α-亚麻酸（LNA）、亚油酸（LA）、共轭亚油酸（CLA）、花生四烯酸（AA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等一些功能性不饱和脂肪酸在酥油中占有一定比例，它们具有降血脂，改善机体生长发育，调节心血管功能，抗坏血栓等多种生理作用，是人体不可或缺的功能因子。

母乳中含有3%～5%的脂肪，为0～6个月的婴儿供给40%～50%的能量和必需脂肪酸，此外母乳脂肪还是脂溶性维生素（维生素D、E等）的输送载体，并协助脂溶性维生素的吸收，因此母乳脂肪对婴儿的生长发育有重要意义[21-23]。母乳脂肪主要由甘油三酯（TAG）组成，而母乳TAG由200多种脂肪酸构成[21]，酥油中丰富的脂肪酸组成与母乳较为接近。母乳中成分及组成由于地域及饮食习惯等因素不同而不尽相同，然而其TGA的sn-2位上主要结构为棕榈酸（P），含量在60%以上，而在TAG的sn-1，3位主要分布着其它不饱和脂肪酸（如油酸，O），这种相对专一的结构，即人们常说的OPO型结构脂[22，24-25]，此结构与婴儿对脂肪的消化吸收以及代谢，甚至与矿物质的吸收有密切相关[22，26]。Innis等[26]和Nielsen 等[27]的研究数据显示，sn-2富含棕榈酸的猪油对比其它原料油更易吸收，而棕榈酸在1、3位则容易导致钙与脂肪吸收减少。

现代社会由于工作压力、生活模式、个人因素等各种客观因素限制，出现母乳营养缺乏甚至不足的情况[21]，寻找合适的原料及途径，开发一种脂肪酸组成特点和分布与母乳相似的脂肪，即母乳脂肪替代脂（Human milk fat substitute，HMFS）具有重要意义。目前市场上婴儿配方奶粉的脂肪是以植物油调配的油脂为主，而较多动物实验[26]和人体试验[22]都证实了婴幼儿对配方中脂肪的吸收低于母乳，不仅影响婴儿的生长发育，而且会增加婴儿便秘、腹痛和肠梗阻发生的可能性[24，28]。考虑到藏耗牛天然放牧的生长特性，生长草原环境的原生态性及其酥油含有丰富的脂肪酸组成，利用酥油这一新兴原料制备母乳替代脂为酥油的综合利用提供了一个新思路和新方向。

本试验通过研究酥油脂肪酸组成特点，筛选其它互补TAG及脂肪酸的脂肪（如OPO型结构脂、米糠油等），以人乳脂肪的脂肪酸组成及位置分布为标准，通过Lingo方程拟合得到不同脂肪的最优物质的量比。以复配后HMFS的总脂肪酸组成，sn-2脂肪酸的相对含量以及PUFA组成作为评价指标，建立HMFS的评价模型。通过这种相似性评价对所得HMFS进行评定，从而制备出一种包含酥油且脂肪酸分布及组成与母乳高度相似的新型母乳替代脂，并为后续研究提供理论依据及参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酥油，西藏宝信股份有限公司；OPO型结构脂、米糠油，江西益海嘉里有限公司。

正己烷（色谱纯），美国天地试剂有限公司（上海）；脂肪酸甲酯标准品，美国Nu-Chekprep公司；胰脂肪酶，美国sigma公司；胆盐，上海晶纯生化科技股份有限公司；其它试剂均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

BS 224S型电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；THZ-82型恒温振荡器，上海仪纯实业有限公司；DHG-9240型电热恒温鼓风干燥箱，江西鼎技科学仪器有限公司；RH B 1 S25型磁力搅拌器，莱贝（上海）科学仪器有限公司；RV10旋转蒸发仪、RE-52旋涡振荡仪，德国 IKA集团；HHS型电热恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；TDL-5-A型台式离心机，上海精密仪器有限公司；HP6890气相色谱仪，美国Agilent公司；KQ-50超声波发生器，昆山市超声仪器有限公司；薄层层析展开缸、碘蒸气层析缸，上海信谊仪器厂；GF254硅胶板，青岛海洋世纪生物工程有限公司；R-501低压旋转蒸发器，上海申顺生物科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 总脂肪酸组成分析对于总脂肪酸分析，依据Lee等[29]称取 2～3 mg样品于螺口试管中，加入 1.5 mL 正己烷，40 μL 乙酸甲酯，100 μL 甲醇化的甲醇钠（0.5 mol/L），置于 37℃水浴反应30 min，放入冰箱冷冻10 min，迅速加入 60 μL饱和草酸溶液，离心除去沉淀。取试管内混合物的上层清液；上层清经无水硫酸钠柱子脱水；将样品经N2吹干，再经正己烷稀释；用1 mL注射器吸取溶液过除颗粒；待气相分析时使用。

1.3.2 sn-2脂肪酸组成分析 根据Luddy等[30]的方法，称取10 mg左右样品于螺口管中，依次加入2.5 mL 0.05%胆盐溶液，1 mL 2.2%CaCl2溶液，10 mg胰脂酶和10 mL Tris-盐酸缓冲液（1 mol/L），将混合液振荡 2 min，置于37℃中水浴反应20 min，期间取出振荡1次。待反应结束后取出冷却，加入5 mL无水乙醚振荡1 min，取上清液过无水硫酸钠柱子，氮气吹干备用。将上述氮气吹干液加入约1 mL正己烷复溶，通过薄层色谱展开法（TLC）展开MAG，展开剂体积为正己烷∶乙醚∶乙酸＝50∶50∶1，接着用碘蒸汽进行显色。刮下MAG条带，甲酯化贮存于-18℃，用于气相分析。

1.3.3 气相色谱条件 气相色谱条件参照赵曼丽[31]的方法，采用Agilent公司带全自动进样系统6890型气相色谱仪，FID检测器，分析柱为CP-Sil88石英毛细管柱（100 m×12.5 mm）；载气 H2；柱头压力 24.52 psi；进样口温度250℃；程序升温：45℃条件下保持4 min，后以13℃/min的速度升温至175℃，并保持27 min，接着以4℃/min的速度升温至215℃，并保持35 min，检测时间86 min。利用面积归一法得到各个脂肪酸的相对百分含量。

1.3.4 母乳替代脂的物理调配 选用与母乳脂肪结构相似的酥油，以及OPO型结构脂、米糠油，同人乳脂肪的脂肪酸组成及位置分布相比较，进行物理磁力搅拌混匀，通过Lingo[32]方程解拟合得到底物最适摩尔配比。

1.3.5 奶粉总脂质的提取 通过真空干燥脱出乳中的水分，同时按照Folch等[33]提出的方法向婴幼儿配方奶粉中加入氯仿/甲醇（2∶1，体积比）的混合物，并充分均质振荡。然后再向体系中加入四分之一体积的食盐水（NaCl，质量分数0.86%），充分振荡，平衡。收集有机相，过滤，并采用旋转蒸发脱除有机溶剂。最后将所得脂质贮存在-18℃条件下，采用上述脂肪酸分析方法。

1.3.6 HMFS及奶粉脂肪酸组成分析 方法同1.3.1节。

1.3.7 HMFS及奶粉sn-2脂肪酸组成分析 方法同1.3.2节。

1.3.8 HMFS的相似性评价 具体评价标准参照Wang 等[34]，包括总脂肪酸组成（＞1%），sn-2 脂肪酸的相对含量（sn-2脂肪酸＞1%），以及 PUFA（＞0.1%）作为指标，建立HMFS的评价模型。

2 结果与分析

2.1 酥油脂肪酸组成与母乳脂肪酸的对比

由表1可以看出，酥油总脂肪酸中约60%为饱和脂肪酸，其中棕榈酸（29.27%）含量较高与人乳中棕榈酸的含量较为接近，酥油还有少量中链脂肪酸，包括辛酸（0.03%）、癸酸（0.69%）、月桂酸（1.73%）和肉豆蔻酸（8.75%），均与母乳中这些短链脂肪酸的含量类似或较为接近，这些中链脂肪酸对婴幼儿健康发展起重要作用[35]。油酸和亚油酸为酥油中主要的不饱和脂肪酸，而酥油中的共轭亚油酸、花生四烯酸、二十二碳五烯酸及二十二碳六烯酸等多不饱和脂肪酸的含量虽不高，却具有特殊的生理功能[16，36]。由于酥油中的硬脂酸含量高于母乳，亚油酸含量低于母乳，为了以酥油为主原料调配与母乳更为相似的母乳脂肪替代脂，本文采用复配形式改进脂肪酸组成。米糠油中虽棕榈酸含量较低（12.23%），但其油酸和亚油酸含量高达70.99%，因此在复配中可为母乳替代脂提供一定比例的亚油酸；OPO结构脂含有较多的棕榈酸和亚油酸，适量添加可补充棕榈酸，使TGA结构更合理。

表1 不同来源酥油与OPO结构脂、米糠油的总脂肪酸组成（%）Table1 Fatty acid profiles of different sources of butter and OPO structural fat，rice bran oil（%）

由表2可看出，酥油sn-2饱和脂肪酸含量为76.13%，其中肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸含量均较高，仅棕榈酸含量就约占饱和脂肪酸总量的57%。分析可知酥油和人乳脂肪中饱和脂肪酸大部分集中在sn-2位，这种分布对饱和脂肪酸以及矿物质的吸收都有重要意义。宋秋等[24]研究证明sn-2位富含棕榈酸的试验组改善了小鼠对脂肪和钙的吸收。OPO型结构脂中棕榈酸（65.48%）大量分布在sn-2位置，其次是油酸，达18.29%，可确定该结构脂的TAG结构是与母乳最为相似即为OPO型。而米糠油sn-2脂肪酸含量最高为油酸（48.23%），其次是硬脂酸（36.72%），棕榈酸含量仅为5.42%。综合表1和表2可看出酥油是制备HMFS较好的原料，然而其亚油酸含量较低，因此可以用米糠油补充，并且可以添加OPO结构脂以补充添加米糠油引起的HFMS中棕榈酸和OPO型TAG的减少，使得最终替代脂的结构与母乳更为相似。

表2 不同来源酥油与OPO结构脂、米糠油的sn-2脂肪酸含量（%）Table2 The sn-2 fatty acid profiles of fatty acid profiles of different sources of butter and OPO structural fat，rice bran oil（%）

2.2 物理混合

相比人乳脂肪的脂肪酸组成及位置分布，根据所添加各油脂产品的脂肪酸特性，所得混合油产品的脂肪酸组成及分布可以通过理论计算得到，按公式（1）计算。

式中，M——终产品的产量，g/mol；Xi——所选各油脂物质的量比；Mi——所选油脂的摩尔质量。为保证在最终产品满足人乳脂肪酸组成及分布的前提下，达到最大油脂添加量（产量），试验采用 Lingo（Linear interactive and general optimizer）对整个油脂添加过程进行优化。

基于以上分析，所建立模型如式（2）所示。

根据人乳脂的脂肪酸组成及分布，所得产品应满足的条件为：

棕榈酸：

硬脂酸：

油酸：

亚油酸：

亚麻酸：

其它：

在此条件下，通过模型优化，以所得最大油脂添加量的比例为中心，设置梯度，以期得到最优添加物质的量比，并按照比例计算称取相应油脂质量，结果如表3所示。在此理论配比下，最终检测终产物与理论值相似度。结果如表4所示，与人乳脂肪相比，所得混合产品的脂肪酸组成及分布均在人乳脂肪范围之内。

表3 酥油，OPO型结构脂，米糠油的物质的量比（mol）与称取质量（g）的换算Table3 The molar ratio and relative mass of yak butter，OPO structural fat，rice bran oil

由表4得出总脂肪酸分布，比例A肉豆蔻酸（2.95%）、硬脂酸（6.27%）含量低于母乳范围，棕榈酸（32.95%）含量高于母乳范围；比例B硬脂酸（4.96%）、油酸（23.86%）含量低于母乳范围，棕榈酸（45.37%）含量高于母乳范围；比例C月桂酸（2.38%）、肉豆蔻酸（5%）含量低于母乳范围，棕榈酸（38.65%）含量高于母乳范围。

表4 混合条件下的终产品的总脂肪酸组成及分布理论计算以及实际测定值Table4 Theoretical and actual values of the final product obtained under the optimum blending conditions

由表5得出sn-2脂肪酸以及百分比分布，比例A棕榈酸（44.68%）含量低于母乳范围，硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等含量均高于母乳范围；比例B肉豆蔻酸、棕榈酸（28.36%）含量低于母乳范围，而硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等含量均高于母乳范围；相比A、B，比例C棕榈酸（45.97%）含量虽低于母乳范围，但在3种比例中含量最高，硬脂酸、油酸、亚油酸含量也均高于母乳范围。综合对比表4和表5，结合母乳TGA及sn-2位脂肪酸特点及分布可知，当以物理混合比例 C（即酥油 ∶OPO 型结构脂 ∶米糠油=0.30∶0.36∶0.15）进行调配，可得到与母乳最为相似的HMFS。具体的量化比较，需要采用更加细化的评估模型对这种最终产物脂肪酸组成及分布进行详细分析。

2.3 HMFS脂肪酸组成分析

在表6中，从市售几种婴幼儿配方奶粉脂肪酸分布情况可以看出，其含量较高的几种脂肪酸为油酸、亚油酸以及棕榈酸，其中也含有一部分短链脂肪酸，这可能是由于其合成原料中添加牛乳导致[14]。每种配方奶粉中均有不同种类及含量的PUFA，这与 Lópezlópez等[38]的研究结果相符，可能由于厂家为提供婴幼儿更全面的营养而添加一部分功能性脂肪酸，以期强化配方奶粉的营养价值[36，38-39]。而经物理混合法产物获得 HMFS对比市售 3种婴幼儿配方奶粉 F1、F2、F3可以看出，HMFS棕榈酸含量（32.82%）远高于其它奶粉，主要因为物理混合底物中几种原料棕榈酸含量较高，而在PUFA组成方面则有一定的差异，提示在后续研究中可以适当添加一定量的PUFA。

表5 混合条件下的终产品的sn-2脂肪酸组成及分布Table5 The sn-2 fatty acid mixed conditions of the composition and distribution of the final product

表6 不同来源HMFS总脂肪酸组成分析（%）Table6 Fatty acid composition of different types of HMFS（%）

由表7、表8可知，sn-2位上，几种市售奶粉含量最高的均为油酸，棕榈酸含量较低，相对含量因奶粉品种不同其最高脂肪酸种类也不同，其中棕榈酸相对含量均较低，可初步判定奶粉的TGA结构与分布同母乳脂肪酸有较大差异，并非理想的HMFS。这种差异可能源于合成配方奶粉原料自身因素的限制，现阶段婴幼儿配方奶粉的合成都是以总脂肪酸组成相似为准则，棕榈酸并不主要分布在TAG的中间位置，这样就直接导致配方奶粉在TAG结构上与母乳存在巨大差异，且不利于婴幼儿对营养的充分吸收。而HMFS的棕榈酸（含量53.71%）主要分布在中间位置，其次为油酸（含量 19.86%），HMFS中短碳链以及长碳链在TAG中间位置都有分布，相对含量最高的是棕榈酸（44.87%），而油酸相对含量在 TAG的中间位置分布较低，初步判定其 TAG结构基本与OPO型结构脂相似，在母乳脂肪中的饱和脂肪酸主要分布在TAG分子中间位置上，可以增强婴儿体内的消化代谢及营养吸收[22，26]。

表7 不同来源HMFS的sn-2脂肪酸组成分析（%）Table7 Sn-2 fatty acid composition of different types of HMFS（%）

表8 不同来源HMFS的sn-2脂肪酸相对含量分析（%）Table8 Relative contents of sn-2 fatty acids of different HMFS（%）

2.4 HMFS的相似性评价

参照Wang等[34]的方法，选择总脂肪酸组成，sn-2脂肪酸的相对含量以及 PUFA组成作为指标，建立HMFS的评价模型：将人乳脂肪的脂肪酸组成及分布，PUFA的组成作为最佳状态，即总分为100，凡是脂肪酸组成及分布、PUFA的组成在人乳脂肪范围内的HMFS，即认为同人乳脂等同，其它HMFS的有些化学成分在人乳脂范围之外，则需要进行相似性评价。相似性评价参考人乳脂肪的脂肪酸，sn-2脂肪酸及PUFA组成及分布，以“扣分”原则，单独对比HMFS中每种相应的脂肪酸含量，sn-2脂肪酸相对含量以及PUFA含量同人乳相应部分的含量区别，计算HMFS同人乳脂肪的相似性。此评价模型如下。

表9 不同来源的HMFS同人乳脂肪的相似性评价（%）Table9 Similarity evaluation of different HMFS based on the evaluation model（%）

式中，Ai（FA/sn2/PUFA/TAG）——HMFS同人乳脂肪在脂肪酸组成，sn-2脂肪酸相对含量以及PUFA组成上相似性，总相似度为100；Bi（FA/sn-2FA/PUFA）——存在差异的总脂肪酸，sn-2脂肪酸以及PUFA需扣除的相似度；Di（FA/sn-2/PUFA）/ΣDi（FA/sn-2/PUFA）——相应的脂肪酸，sn-2脂肪酸及PUFA的相对含量；Ci（FA/sn-2FA/PUFA）——浮动系数，主要由HMFS中的脂肪酸，sn-2脂肪酸及PUFA的含量决定；Fi（FA/sn-2/PUFA）——人乳脂肪中相应脂肪酸，sn-2脂肪酸及PUFA的上限和下限值。当HMFS中的脂肪酸，sn-2脂肪酸及PUFA的含量依次超过、低于母乳脂肪相应含量范围时，相对应的取 Ei（FA/sn-2/PUFA）上限值、下限值，当其含量在母乳脂肪相应含量范围时，Ci（FA/sn-2FA/PUFA）为零。由以上所建模型可知，一种合格的HMFS需经过2个步骤的评价，分别是总脂肪酸组成和sn-2脂肪酸相对含量的初级评价和PUFA组成的评价。

由表9可以看出市面上销售的3种婴幼儿配方奶粉F1、F2、F3相似度基本一致，均为在总脂肪酸组成上能达到较高相似度，依次为98.7%，91.6%，89.4%，然而在sn-2脂肪酸以及PUFA组成上差异较大。物理混合法制备的HMFS在总脂肪酸含量上，相似度达到89.4%，sn-2脂肪酸相似度为65.3%，PUFA含量相似度为99.8%，结果较理想。

综合比较4种HMFS可以发现，它们均在总脂肪酸组成方向上达到一定相似度，而另2个指标高低不等，这主要与原料以及合成方式有关。因此，要得到最为相似的产物，则需从反应原料以及合成手段入手。相比婴幼儿配方奶粉，终产物HMFS表现出更大的优势，其较高的sn-2脂肪酸和PUFA组成有可能更好的被婴幼儿吸收并提供更丰富的营养，这为酥油作为制备母乳替代脂的原料以及酥油综合利用及产品开发提供理论依据和参考价值。

3 结论与讨论

通过物理混合方式，选用与母乳脂肪酸组成与结构较为相似的酥油脂肪为底物，辅以OPO型结构脂和米糠油，根据各自脂肪酸组成特点进行互补，以期得到与母乳脂肪较为相似的替代脂。在此过程中先选用 Lingo模型进行拟合得出各脂肪的最优物质的量比，即按酥油∶OPO结构脂∶米糠油 =0.30∶0.36∶0.15（物质的量比）进行调配时，可以得到脂肪酸组成和分布与母乳最为相似的HMFS。

通过建模，对最优物质的量比制备的HMFS进行相识度评价，发现尽管在总脂肪酸、sn-2脂肪酸、PUFA方面HMFS还有待改善，但物理混合法制得的HMFS在PUFA含量相似度高达99.8%，总脂肪酸含量上面相似度也达到了89.4%，sn-2脂肪酸相似度则为65.3%。虽sn-2相似度还需继续研究以提高其比例，但总体上看，以酥油为原料制备的HMFS相比市售奶粉具有更大的优势及潜力，本研究为利用酥油制备HMFS提供了理论依据及参考。