螺旋藻多糖对酪氨酸酶的抑制作用及抗氧化性能

丁小梅 何善生 王 力 李 健 李桂玲

（集美大学食品与生物工程学院 福建厦门 361021）

螺旋藻多糖（Polysaccharide from S.platensis，PSP）是一种具有多种生物活性的水溶性功能性生物大分子[1]，其分子结构较复杂，主要是由D-葡萄糖、D-半乳糖及葡萄糖醛酸等通过糖苷键连接而成[2-3]。研究发现，螺旋藻多糖在抗肿瘤[4-5]，抗氧化[6-7]，抗病毒活性[8]，免疫机能的调节[9-10]，血糖调节[11]，抗疲劳[12]，抗衰老[13]等方面发挥着重要作用。积极开展螺旋藻多糖的深入研究，必能在食品添加剂、功能性药品、保健品等领域的研究与开发方面提供极大助力[14]。

酪氨酸酶（EC1.14.18.1，TYR）是一种活性中心含有Cu2+的多功能氧化酶[15]，同时也是反映黑色素生物合成中限速效应的关键酶[16]。酪氨酸酶可通过两步催化使L-酪氨酸转化为多巴醌，这是果蔬褐变的重要原因[17]。开发安全、高效的酪氨酸酶抑制剂对抑制果蔬褐变[18]和食品保鲜[19]等方面具有重要意义。螺旋藻多糖作为一种无毒、高效，具有多种生物活性的功能性生物大分子[1]，具有重要的研究价值。本文在酶动力学试验的基础上，以螺旋藻多糖为效应物（抑制剂），探究其对酪氨酸酶活力的抑制作用，希望能为以螺旋藻多糖为主要活性组成的新型食品保鲜剂的研究、开发与应用提供一定数据基础和理论依据[20]。

螺旋藻多糖分子中含有大量的糖醛酸、酚羟基等基团[21-22]，具有抗氧化，清除自由基的活性[2]，可有效延缓食品氧化过程，防止食品氧化变质[20]。本文以试验所得螺旋藻多糖为主要试剂，通过DPPH自由基清除法，对其自由基清除能力进行验证，以期为其在抗氧化剂、食品保鲜等方面的应用研究提供更为客观、综合的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

螺旋藻干粉，福建省神六保健食品有限公司；无水乙醇、三氯乙酸、丙酮、L-抗坏血酸、硫酸、二甲基亚砜（DMSO）、NaH2PO4、Na2HPO4，西陇化工股份有限公司；NaOH，上海化学试剂总厂；L-多巴、蘑菇酪氨酸酶，上海西格玛有限公司；蒽酮、盐酸，国药集团化学试剂有限公司；DPPH、葡萄糖，上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 主要仪器及设备

Nicolet Avatar 330型傅里叶变换红外光谱仪，美国Thermo Electron公司；Cintra 2020型紫外可见分光光度计，澳大利亚GBC仪器公司；3-30KS高速冷冻离心机，德国Sigma公司。

1.3 试验方法

1.3.1 绘制葡萄糖标准曲线（硫酸-蒽酮法[23-24]） 配制质量浓度为0.113 mg/mL的葡萄糖标准溶液，分别取不同体积的该葡萄糖标准溶液，蒸馏水定容至10 mL，配制成一系列浓度梯度的葡萄糖标准溶液，摇匀，再各取1 mL上述葡萄标准溶液于具塞试管中，同时取1 mL蒸馏水作空白对照，冰浴5 min。再加入4 mL 0.2%硫酸-蒽酮溶液，摇匀后沸水浴15 min，随后冷却至室温，静置10 min，测定其在620 nm波长处的吸光度值。以吸光度值（A）为纵坐标，葡萄糖标准品的浓度（C）为横坐标，得到二者之间的标准关系曲线，用于计算螺旋藻多糖提取物中的多糖含量。

1.3.2 螺旋藻多糖提取工艺的优化研究

1.3.2.1 螺旋藻多糖的提取与纯化[25]取一定质量的螺旋藻干粉，在95%乙醇中浸泡过夜，离心后取沉淀，37℃烘干；加入适量蒸馏水，用1 mol/L NaOH溶液调pH值为10，80℃水浴加热3 h；离心取上清液，用1 mol/L盐酸调节上清pH值为7.0，逐滴加入5%三氯乙酸，4℃静置3 h后离心取上清液，重复上述操作，去除上清液中的蛋白；加入约3倍上清液体积的95%乙醇，4℃下放置过夜；离心取沉淀，用丙酮洗涤2～3次，对沉淀进行冷冻干燥处理后，即可得到螺旋藻多糖产品。

1.3.2.2 螺旋藻多糖提取条件的优化 选取对试验结果具有较大影响的4个因素，即提取时间（t），料液比（M），提取温度（T）和pH 值，进行 4 因素3水平的正交试验，优化螺旋藻多糖的提取条件，获得最佳提取工艺，正交试验设计如表1所示。

表1 正交试验设计Table1 Orthogonal experimental design

1.3.3 螺旋藻多糖对酪氨酸酶抑制效果的研究酪氨酸酶可以催化L-多巴生成多巴色素，多巴色素在波长475 nm处具有最大吸收[26-27]。具体操作根据参考文献[20]所提供的方法：取0.1 mL的酪氨酸原酶溶液，与0.9 mL的PBS溶液（pH 6.8）混匀，在0℃暂存。称取不同质量的螺旋藻多糖，用DMSO 配制成不同质量浓度（4，12，20，28，36，40，44，52，60，80，100 mg/mL）的多糖溶液（效应物）。取一定量的0.5 mmol/L L-多巴溶液，在30℃下水浴10 min。在比色皿中，加入2.8 mL的L-多巴溶液，0.1 mL效应物，混匀后调零，再加0.1 mL酪氨酸酶溶液，混匀后立即在475 nm波长进行连续扫描，得到吸光度与时间的变化关系曲线。同时用0.1 mL不含效应物的DMSO空白对照，消光系数ε=3700 L·mol-1·cm-1[28]，直线的斜率为相对酶活，绘制相对酶活与多糖浓度（CI）之间的关系图。

1.3.4 螺旋藻多糖对酪氨酸酶抑制机理的研究 以0.5 mmol/L的L-多巴溶液为底物，在上述反应体系中，研究螺旋藻多糖对酪氨酸酶的抑制机理[20，29]。 分别取酶酪氨酸原酶 40，60，80，100，120 μL，用pH 6.8的PBS溶液稀释，定容至1 mL；分别称取螺旋藻多糖样品 0.1，0.3，0.5，0.7 g，用 DMSO配制成不同浓度的多糖溶液（效应物），测定不同浓度的效应物对酪氨酸酶抑制活力的影响。以剩余酶活为纵坐标，以酶浓度（CE）为横坐标，绘制剩余酶活与酶浓度之间的关系曲线。根据直线的相交、平行情况，直线斜率变化情况，探究效应物对酪氨酸酶的抑制机理[20，30]。

1.3.5 螺旋藻多糖对酪氨酸酶抑制类型和抑制常数的测定 抑制剂类型的测定采用上述同样的测定体系，通过固定酶液浓度（酪氨酸酶质量浓度6.207 μg/mL），改变底物浓度（L-多巴液浓度分别为0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mmol/L）和抑制剂的浓度（螺旋藻多糖溶液质量浓度分别为4，12，20，28 mg/mL），探究不同浓度的抑制剂对酪氨酸酶活力的影响。本试验采用Lineweaver-Burk双倒数作图法，以反应速率的倒数（V-1）对底物浓度的倒数（CS-1）作图，观察直线的相交情况以及横纵轴截距[20，31]，以直线斜率为纵坐标，抑制剂浓度（CI）为横坐标，进行二次作图，可得该效应物对酪氨酸酶的抑制常数（KI），从而判断出螺旋藻多糖对酪氨酸酶的抑制类型[32]。

1.3.6 螺旋藻多糖清除DPPH自由基的研究 螺旋藻多糖对DPPH自由基清除能力的研究参照Duan 等[33]的方法：称取 0，5，10，15，20，25 mg 螺旋藻多糖，用DMSO定容至25 mL，然后分别吸取上述不同浓度的螺旋藻多糖溶液2 mL，置于10 mL的具塞比色管中，每管中各加入2 mL的82 μg/mL DPPH溶液，混匀后，室温避光条件下静置30 min，随后倒入比色皿中，测定其在517 nm波长下的吸光度值Ai。其中螺旋藻多糖添加量为0（即未添加螺旋藻多糖）的一组，为空白组，其吸光度值记为A0。取2 mL 95%乙醇于比色皿中，加入2 mL的多糖溶液，测得吸光度值Ai0（即为调零组），以排除样品本身颜色的干扰[20]。通过式（1），判断螺旋藻多糖的自由基清除能力情况。

式中，Ai——试验组的吸光度值；A0——空白组的吸光度值；Ai0——调零组的吸光度值。

为了更直观地说明螺旋藻多糖的自由基清除能力的强弱，配制相同浓度的L-抗坏血酸溶液，按上述操作，通过对比对螺旋藻多糖的自由基清除能力进行说明。

2 结果与分析

2.1 绘制葡萄糖标准曲线

根据硫酸-蒽酮法绘制标准的葡萄糖标准曲线如图1所示。

图1 葡萄糖标准溶液标准曲线Fig.1 Glucose standard solution standard curve

由图1可知，所得葡萄糖标准曲线在0～0.565 mg/mL的范围内线性良好，即在0～0.565 mg/mL的范围内，葡萄糖标准溶液浓度（C）与其对应吸光度之间具有良好的线性关系。其回归方程：A=7.4856C+0.0068（R2=0.9918）。

2.2 螺旋藻多糖提取条件的优化

通过正交试验，优化了螺旋藻多糖的提取工艺，获得最佳提取条件。其正交试验结果如表2所示。

表2 正交试验结果Table2 Orthogonal experimental results

由表2可知，在所选的4个因素中，提取温度对多糖提取率的影响最为重要，其次为料液比、pH值，提取时间对多糖提取率的影响则相对最弱。提取螺旋藻多糖的最佳工艺组合：A2B3C3D1，即在提取时间2 h，提取温度90℃，pH 8，料液比1∶40的条件下，理论上可以获得最高的提取率。通过验证试验结果可知，在上述最佳提取工艺条件下，螺旋藻多糖的提取率可高达1.50%。

2.3 螺旋藻多糖对酪氨酸酶的抑制效果

以酪氨酸酶相对活性对效应物（螺旋藻多糖）浓度（CI）作图，如图2所示。

由图2可知，酪氨酸酶活性与多糖溶液浓度成反比，说明该效应物对酪氨酸酶具有抑制作用。当抑制剂质量浓度<2.0 mg/mL时，酪氨酸酶酶活迅速下降，此后，酶活下降速度稍缓。测得导致酪氨酶活力下降50%的螺旋藻多糖质量浓度（IC50）为1.193 mg/mL。

图2 多糖溶液对酪氨酸酶抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of polysaccharide inhibitor on tyrosinase

2.4 螺旋藻多糖对酪氨酸酶的抑制机理

以0.5 mol/L的L-多巴溶液为底物，通过测定不同浓度下螺旋藻多糖对酪氨酸酶的抑制效果，从而判断其抑制机理。结果如图3所示。在图3中，以剩余酶活力为Y轴，以酶浓度为X轴绘图，得到5条斜率与效应物浓度呈反比的、交于原点的直线，即螺旋藻多糖对酪氨酸酶的抑制机理属于可逆抑制[32]。说明多糖与酪氨酸酶是通过非共价键结合的，且其结合是可逆的。效应物的抑制作用只是使酶活降低，对其有效酶量并未产生影响[19-20，32]。

2.5 螺旋藻多糖对酪氨酸酶的抑制类型及抑制常数

在不同浓度的螺旋藻多糖和L-多巴底物的反应体系中，酶质量浓度为6.207 μg/mL，测定在不同浓度的螺旋藻多糖溶液中，酶促反应速率的变化情况。即研究效应物多糖对酪氨酸酶活力的影响。以反应速率的倒数（V-1）和底物浓度的倒数（CS-1）为研究指标，采用 Lineweaver-Burk双倒数作图法作图，判断其抑制类型[20，33]，结果如图4所示，得到一组直线，该组直线相交于第二象限，且直线在坐标轴上的截距与多糖浓度之间存在一定变化规律，说明螺旋藻多糖对酶促反应的最大反应速率（Vmax）和米氏常数（Km）均产生了影响[19-20]。因为Km与效应物多糖浓度之间成正比关系，而Vmax则相反，故可判断其抑制类型为混合型。以图4中各直线的斜率为Y轴，多糖浓度为X轴，再次作图，即图4中的插图。可求出抑制常数KI为0.544 mg/mL。

图3 多糖溶液对酪氨酸酶抑制机理的测定Fig.3 Determination of tyrosinase inhibitory mechanism by polysaccharide inhibitors

图4 多糖溶液对酪氨酸酶抑制类型及其抑制常数的测定Fig.4 Determination of tyrosinase inhibition type and its inhibition constant by polysaccharide inhibitor

2.6 螺旋藻多糖清除DPPH自由基的效果

螺旋藻多糖、L-抗坏血酸对DPPH自由基的清除效果如图5所示。由图5可知，螺旋藻多糖对DPPH自由基清除能力与其浓度成正比，在质量浓度0～0.6 g/L范围内，DPPH自由基清除能力上升较为迅速，其后变化趋于缓和，得到其半清除率（IC50）为0.463 g/L。由图5可以看出，质量浓度为1.0 g/L的螺旋藻多糖的自由基清除率分别为71.49%和86.42%，故可知螺旋藻多糖具有较强的抗氧化能力[20]。

图5 螺旋藻多糖对DPPH自由基清除效果Fig.5 Spirulina polysaccharide scavenging DPPH free radical

3 结论

本文通过对螺旋藻多糖提取工艺、螺旋藻多糖对酪氨酸酶抑制作用与机理及其抗氧化能力的研究，可以得知：在提取时间2 h，料液比1∶40，提取温度90℃，pH 8的条件下，螺旋藻多糖得率较高，可达到1.50%；螺旋藻多糖对酪氨酸酶具有较好的抑制效果，其IC50为1.193 mg/mL，其抑制过程属于可逆的混合型抑制，抑制常数KI为0.544 mg/mL。螺旋藻多糖对DPPH自由基清除率最高可达71.94%，与同浓度下的L-抗坏血酸相比，可知其具有较强的抗氧化能力。因此，开展螺旋藻多糖在防止果蔬褐变、食品保鲜、抗氧化剂、酶抑制剂等方面的相关研究工作具有重要意义。以期为螺旋藻多糖后续更为深入的实际应用机理及毒理学研究，提供较为综合、科学、客观的试验及理论依据。