十溴二苯乙烷对部分血糖内分泌干扰的计算机辅助理论研究

张天庆，杨秀榕，曾凡刚，张严,*

1. 中央民族大学生命与环境科学学院，北京 100081 2. 中国人民大学环境学院，北京 100872

十溴二苯乙烷(decabromodiphenyl ethane, DBDPE)是一种高效、环保的溴代阻燃剂，长期以来被人们认为难以进入环境以及生物体内并产生蓄积。然而，在2003年，Kierkegaard等[1]首次从下水道淤泥中检测出DBDPE。随后一些调查表明DBDPE已广泛分布在水、空气和土壤中[2-7]。何明靖等[7]通过对卤系阻燃剂在东江鱼体中的生物富集研究发现DBDPE在东江鱼体内的富集能力较强，余乐洹等[8]在我国北京地区的红隼体内发现DBDPE的存在，任子贺等[9]在对水生和陆生生物体中卤系阻燃剂的差异性富集研究中，发现DBDPE在鲶鱼和家鸽中存在，综合以上以及其他的调查研究可知，DBDPE已经广泛存在于生物体内。另外，有研究表明DBDPE已进入食物链中[10-11]。Wang等[12]在对中国北京室内尘埃中溴系阻燃剂研究中发现，DBDPE已经成为主要的溴系阻燃剂，并且DBDPE的中值水平不仅比其他新型溴系阻燃剂高出几个数量级，而且比3种传统溴系阻燃剂高出3～27倍。另外，还有研究表明人会通过呼吸、饮食等方式摄入DBDPE[13]。目前，DBDPE使用量逐年增长，在环境和生物体内的蓄积程度呈上升趋势，而且带来的健康风险性较高，因此部分学者对其展开了毒理学和流行病学研究。

Jin等[14]使用斑马鱼作为体内模型评价了DBDPE的毒理学效应，结果显示，在短期暴露于不同浓度DBDPE污染的沉积物时，斑马鱼的死亡率和畸形率均未受影响，但是DBDPE对斑马鱼幼鱼具有低神经毒性，该研究结果揭示了DBDPE在实际环境中的潜在风险。韩倩等[15]通过DBDPE对草鱼幼鱼肝脏和肌肉组织氧化应激效应的影响研究发现，DBDPE暴露影响草鱼幼鱼肝脏组织的抗氧化防御系统，可以诱导草鱼幼鱼产生氧化应激效应。Sun等[16]对BALB/c小鼠进行不同剂量的DBDPE灌胃给药，30 d后，处死小鼠，取血、肝脏和甲状腺，分离肝微粒体，测定血糖、胰岛素和甲状腺激素水平，结果表明，DBDPE除了可引起一定程度的肝脏损伤和肝功能不全外，还具有内分泌干扰活性，而且DBDPE的内分泌干扰活性会影响血糖代谢水平，但目前其作用机制尚未得出。为了探究其具体机制，缩短研究时间，降低研究成本，本文采用计算机辅助研究的方法对DBDPE影响血糖的代谢机制进行探究，为后续的实验研究提供理论依据。

当前已进行的体内外研究和流行病学研究结果显示，内分泌干扰物(EDCs)可通过干扰生物体内分泌过程来影响机体的生理过程，其发挥干扰作用时，一是直接作用于机体内受体，干扰机体对外源性化学物质的代谢，进而引起机体本身的代谢紊乱；二是直接作用于机体特异性代谢受体，形成同型二聚体或异二聚体，进而与特定的靶基因结合，干扰下游基因的表达，进而干扰胰岛素等激素水平，从而影响机体的正常代谢[17]。机体的内分泌通路中与血糖相关的有芳香烃受体介导、雌激素、孕激素、甲状腺激素和雄激素等内分泌通路[18-21]，因此，本文采用上述通路所提及的与血糖相关的受体进行研究，以探究出DBDPE是否与这些受体结合而发挥干扰内分泌作用而影响机体正常代谢，进而影响机体血糖代谢。具体过程是将DBDPE与雌激素受体(estrogen receptors, ERs)包括ERα和ERβ、孕激素受体(progesterone receptor, PR)、甲状腺激素受体(thyroid hormone receptor, TR)包括TRα和TRβ、雄激素受体(androgen receptor, AR)、芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor, AhR)进行分子对接实验(图1)。另外，基于DBDPE类似物(均为EDCs)分子的三维结构以及Richards[22]和Chen等[24]提供的这些分子的EC50(根据实验要求将该活性数值转换为-logEC50)，采用比较分子力场分析法(CoMFA)构建3D-QSAR模型，CoMFA是构建3D-QSAR模型的主要方法之一，由于其预测能力强，模型形象直观而受到广泛应用[23,25]。在进行实验时，首先综合考虑CHARMM力场和静电场等对这些分子进行场叠合，再对能量网格电位进行滤波，去除高度相关的描述符，之后使用剩余的描述符来建立偏最小二乘(PLS)模型，即3D-QSAR模型，以此预测未知内分泌干扰物的干扰活性，这为实验研究提供了理论依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

DBDPE及其类似物的结构数据来源于PubChem数据库，分子对接实验所需的全部受体结构来源于PDB蛋白质晶体结构数据库，DBDPE类似物的活性数据来源于Richards[22]和Chen等[24]等的研究。所有分子对接计算以及构建3D-QSAR模型均在宝德RR2510N计算机工作站完成，所用软件采用美国Accelrys公司研发的Discovery Studio(DS)3.5分子设计软件包，计算中选用的各项参数除特别说明外均使用缺省值。

图1 实验所需受体结构与十溴二苯乙烷(DBDPE)结构注：Erα为雌激素受体α，来源于文献[26]；Erβ为雌激素受体β，来源于文献[27]；PR为孕激素受体，来源于文献[28]；TRα为甲状腺激素受体α，来源于文献[29]；TRβ为甲状腺激素受体β，来源于文献[30]；AhR为芳香烃受体，来源于文献[31]；AR为雄激素受体，来源于文献[32]。Fig. 1 Receptor structure and decabromodiphenyl ethane (DBDPE) structure in receptor-ligand interactionsNote: ERα is estrogen receptor α and refers to literature [26]; ERβ is estrogen receptor β and refers to literature [27]; PR is progesterone receptor and refers to literature [28]; TRα is thyroid hormone receptor α and refers to literature [29]; TRβ is thyroid hormone receptor β and refers to literature [30]; AhR is aryl hydrocarbon receptor and refers to literature [31]; AR is androgen receptor and refers to literature [32].

1.2 实验方法

1.2.1 分子对接实验

本部分以ERα为例，用DS3.5软件首先进行DBDPE与ERα的预处理，具体过程是：利用Small Molecules模块中Prepare or Filter Ligands功能对DBDPE进行结构优化并将其定义为配体分子；点击Chemistry进行ERα的加氢处理，在蛋白质的结构面板内删掉水分子，利用Define and Edit Binding Site功能定义ERα为受体分子，并找到结合位点(12个)。

然后进行分子对接实验，具体过程是：

(1)用DS3.5软件中Receptor-Ligand Interactions模块的Lib Dock功能进行刚性对接实验，在调整参数时，除Max Hits to Save参数设为10(以缩短计算时间)，其余均为默认值，对接结果显示，ERα的12个结合位点中有5个能够与DBDPE完成刚性对接；

(2)用Receptor-Ligand Interactions模块中的Ligand Fit功能在刚性对接得到的5个结合位点的基础上进行半柔性对接实验，在调整参数时，输入的结合位点更改成能够完成第一步对接的5个结合位点，结果只有2个结合位点能够完成半柔性对接；

(3)用Receptor-Ligand Interactions模块中的Flexible Docking功能在半柔性对接得到的2个结合位点的基础上进行全柔性对接实验，根据实验结果的打分函数来评估ERα与DBDPE的结合情况。

1.2.2 构建3D-QSAR模型

软件中导入DBDPE的类似物，输入半最大效应浓度的负对数值(-logEC50)，进行预处理，再将其分为训练集(如表1)和测试集，利用Small Molecules模块中的Create 3D QSAR Model功能构建DBDPE类似物的3D-QSAR模型。

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 分子对接结果

在刚性对接的过程中，DBDPE能够在ERα的5个结合位点、ERβ的6个结合位点、PR的4个结合位点、TRα的2个结合位点、TRβ的1个结合位点、AR的2个结合位点以及AhR的2个结合位点处与相应受体结合。在半柔性对接的过程中，DBDPE能够在ERα的2个结合位点，ERβ的2个结合位点，PR的3个结合位点，TRα的1个结合位点处与相应受体结合(表2)。

表1 训练集的分子结构和活性数据Table 1 The structure and activity data of training set molecules

续表1名称Name-logEC50结构Structure2,2’,4,4’-四氯联苯2,2’,4,4’-Tetrachlorobiphenyl4.092,3,7,8-四氯二苯并呋喃2,3,7,8-Tetrachlorodibenzofuran8.122,3,4,5-四氯联苯2,3,4,5-Tetrachlorobiphenyl4.853,3’,4,4’-四氯联苯3,3’,4,4’-Tetrachlorobiphenyl7.372,3,6,8-四氯二苯并呋喃2,3,6,8-Tetrachlorodibenzofuran7.662,3,3’,4,4’-五氯联苯2,3,3’,4,4’-Pentachlorobiphenyl5.852,2’,4,4’,5,5’-六氯联苯2,2’,4,4’,5,5’-Hexachlorobiphenyl5.102,3,3’,4,4’,5-六氯联苯2,3,3’,4,4’,5-Hexachlorobiphenyl6.301,2,4-三氯二苯并-对-二恶英1,2,4-Trichlorodibenzo-p-dioxin5.881,2,4,6,7,8-六氯二苯并呋喃1,2,4,6,7,8-Hexachlorodibenzofuran6.08

注：活性数据来源于文献[22-25]；-logEC50为半最大效应浓度的负对数值。

Note: The active data are derived from the literature [22-25]; -logEC50is the negative value of the half maximum effect concentration.

表2 DBDPE与内分泌干扰物受体的刚性对接和半柔性对接结果Table 2 Lib Dock and Ligand Fit results between DBDPE and endocrine disruptor receptors

在全柔性对接实验中，利用了多种打分函数来评估配体与受体的全柔性分子对接结果，主要参考值是配体与受体之间的相互作用能(CDOCKER interaction energy, CIE)。CIE越低表示配体与受体结合越强，对接结果越好，CIE越高则相反。DBDPE与4种受体的全柔性对接结果列于表中(表3～6)，配体与受体全柔性分子对接的相互作用如图2～5所示(注：每种受体只列出一个对接结果最好的结合位点)。

从表3可知，CIE最高为-26.22 kJ·mol-1，最低为-43.65 kJ·mol-1，说明对接过程所需的相互作用能非常小，对接结果是合理可靠的。

选取CIE最低的构象1(结合比较稳定)，二者的相互作用二维图如图2所示，其中DBDPE与ERα侧链上的520号赖氨酸、381号丝氨酸与515号精氨酸存在氢键相互作用(蓝色箭头表示DBDPE与侧链上氨基酸存在氢键相互作用)，与520号赖氨酸存在π-阳离子相互作用(由橙色线表示)。氢键相互作用以及π相互作用的存在对配体与受体结合的稳定情况具有重要作用。

从表4可知，CIE最高为-32.58 kJ·mol-1，最低为-42.59 kJ·mol-1，说明对接过程所需的相互作用能非常小，对接结果是合理可靠的。

选取CIE最低的构象4(结合比较稳定)，二者的相互作用二维图如图3所示，其中DBDPE与ERβ侧链上的329号精氨酸和383号苏氨酸存在氢键相互作用，与464号组氨酸存在π-π相互作用，与386号精氨酸存在π-阳离子相互作用。氢键相互作用以及π相互作用的存在对配体与受体结合的稳定情况具有重要作用。

从表5可知，CIE最高为-40.72 kJ·mol-1，最低为-53.77 kJ·mol-1，说明对接过程所需的相互作用能非常小，对接结果是合理可靠的。

选取CIE最低的构象1(结合比较稳定)，二者的相互作用二维图如图4所示，其中DBDPE与PR侧链上的777号酪氨酸、728号丝氨酸和822号赖氨酸存在氢键相互作用，氢键相互作用的存在对配体与受体结合的稳定情况具有重要作用。

从表6可知，CIE最高为-37.57 kJ·mol-1，最低为-42.78 kJ·mol-1，说明对接过程所需的相互作用能非常小，对接结果是合理可靠的。

选取CIE最低的构象1(结合比较稳定)，二者的相互作用二维图如图5所示：其中DBDPE与TRα侧链的330号丝氨酸存在氢键相互作用，氢键相互作用的存在对配体与受体结合的稳定情况具有重要作用。

在分子对接实验中，DBDPE与ERα、ERβ、PR和TRα的对接结果较好，说明DBDPE是通过与这

表3 DBDPE与ERα的全柔性对接结果Table 3 Flexible docking results between DBDPE and ERα

注：CIE表示配体与受体之间的相互作用能。

Note: CIE stands for CDOCKER interaction energy.

表4 DBDPE与ERβ的全柔性对接结果Table 4 Flexible docking results between DBDPE and ERβ

图2 DBDPE与ERα的相互作用二维图Fig. 2 X-Y scheme of interaction between DBDPE and ERα

图3 DBDPE与ERβ的相互作用二维图Fig. 3 X-Y scheme of interaction between DBDPE and ERβ

表5 DBDPE与PR的全柔性对接结果Table 5 Flexible docking results between DBDPE and PR

表6 DBDPE与TRα的全柔性对接结果Table 6 Flexible docking results between DBDPE and TRα

些受体结合而发挥内分泌干扰活性作用，进而影响血糖代谢水平，另外根据DBDPE与不同激素受体的对接结果可得出DBDPE对生物内分泌干扰在性别方面存在差异。

图4 DBDPE与PR的相互作用二维图Fig. 4 X-Y scheme of interaction between DBDPE and PR

图5 DBDPE与TRα的相互作用二维图Fig. 5 X-Y scheme of interaction between DBDPE and TRα

2.2 3D-QSAR模型

建立的模型通过训练集的实验值与预测值的回归曲线(图6)来表示，在此曲线中，横坐标是实验值，纵坐标是预测值，R-square值为0.989，R-square是可决系数，反映模型对样本数据的拟合程度，范围是0

通过测试集的测试(表7)，我们可以看到实验值与预测值的残差并不大，这也说明结果较好，于是我们又利用模型得到DBDPE的预测值(-LogEC50)，是5.86，与其他类似物相差较小。通过以上结果，我们得出结论：我们构建的3D-QSAR模型置信度较高。另外，本实验所找的DBDPE类似物大多数属于内分泌干扰物，它们通过发挥内分泌干扰活性作用影响血糖代谢水平，由于预测的值与其类似物的值较为接近，所以我们可以得出：与DBDPE类似的其他内分泌干扰物在血糖的内分泌干扰方面具有相近的作用。

图6 训练集的实验值与预测值的回归曲线Fig. 6 Regression curve of experimental value and predicted value of training molecules

图7 外部验证实验的测试集的回归曲线Fig. 7 Regression curve of test set for external validation test

综上所述：通过DS 3.5中的分子对接功能将DBDPE与血糖内分泌代谢过程有关的受体进行对接，并利用DBDPE类似物的三维结构与活性数据构建3D-QSAR模型，最终得出如下结论：

(1)DBDPE能够与部分血糖内分泌受体(ERα、ERβ、PR和TRα)进行全柔性对接，相互作用能很强，说明对接结果较为稳定，这表示DBDPE是通过与这些受体结合，对后续的内分泌通路产生影响，进而影响血糖代谢水平。

(2)从对接结果发现，DBDPE能够与雌激素受体和孕激素受体结合，而不能够与雄激素受体结合，说明DBDPE对生物内分泌的影响在性别方面有一定的差异，这与前述的Sun[16]的实验研究结果相符。

表7 测试集的实验值与预测值的关系Table 7 The relationship between experimental value and predicted value of the test set molecules

注：各种化合物的实验值来源于文献[22-25]。

Note: The experimental values of various compounds are derived from document [22-25].

(3)通过构建3D-QSAR模型，预测出类似DBDPE未知内分泌干扰物的EC50，认为对生物代谢方面的影响具有一定的相似性。

目前，国内外开展的针对DBDPE的毒理学相关研究和评价资料比较少，且研究结果之间存在一定的差异，本文的计算机辅助研究为DBDPE在内分泌干扰方面的实验研究提供了理论依据。