白香丹胶囊配伍四逆散治疗焦虑大鼠的疗效及其对血清NE、5-HT、BDNF水平的影响

焦虑症是以焦虑情绪为主要特点的常见神经症，临床表现为持续性、广泛性的紧张、惊恐不安，同时伴肌肉紧张、神经紊乱、运动性不安。目前西医治疗以丁螺环酮、苯二氮卓类等药物为主，但易出现耐受性及不良反应，依从性差[1]。近年来中医药治疗焦虑症优势突出。有研究表明，四逆散对心理应激密切相关的焦虑、抑郁具有治疗效果[2]；白香丹胶囊由香附、白芍、丹皮等有效成分组成，已有研究证实其对神经精神性疾病症状存在改善作用[3]。但目前关于二者的作用机制及配伍治疗效果的研究报道较少。有关文献报道，单胺类神经递质5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)以及脑源性神经营养因子(BDNF)水平与神经病症的产生、进展有关[4-5]。基于此，本研究采用足底电击法构建焦虑大鼠模型，旨在探讨白香丹胶囊配伍四逆散干预治疗焦虑的效果及其对血清NE、5-HT及BDNF水平的影响，探讨其作用机制，为临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取48只SPF级健康雄性Wistar大鼠为实验对象，购自新疆医科大学动物实验研究中心[实验合格证：XJYK(新)2017-0020]。大鼠体质量180～210 (200.08±26.73)g。实验前7 d购入并安置于实验室适应环境：室温(22±2)℃，湿度50%～60%，光照节律12L/12D(08：00～20：00)；自由饮水、摄食。

1.2 药物及试剂 白香丹胶囊(青岛海川生产)；四逆散(广州一方制药有限公司)。组方：白芍、柴胡、炙甘草、枳实颗粒剂，均12 g。NE、5-HT试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；BDNF试剂盒(美国R&D公司)。

1.3 主要仪器 XR-XZ301型旷场实验箱、XR-XG201型高架十字迷宫(EPM)、XR-Xmaze型动物行为分析系统(上海欣软信息科技有限公司)；ST-A数字脉冲生物刺激仪(济南空军后勤装配总厂联合山东中医药大学研制)；Universal 16R台式离心机(德国Hettich)。

1.4 方法

1.4.1 焦虑大鼠模型制备及实验分组 大鼠经7 d适应环境后，随机分为4组：空白组、模型组、四逆散组、中药联合组，每组12只。空白组，不行电击，正常饲养，每日给予10 mL/kg无菌纯水灌胃。模型组通过ST-A数字脉冲生物刺激仪，凭借足底电击法诱导大鼠焦虑行为，即放置大鼠于激惹、噪音、脉冲电刺激笼中，以足部刺激为主，电压2 800～3 300 V，电流0.5 mA，脉宽0.3 s，白昼、夜间分别2档(间隔5 min)、3档(间隔10 min)，刺激持续2周，造模同时每日给予10 mL/kg无菌纯水灌胃。四逆散组造模方法不变，每日给予四逆散水煎液3.6 g/kg灌胃。中药联合组，造模方法不变，每日给予白香丹胶囊200 mg/kg+四逆散水煎液3.6 g/kg灌胃。4组均干预观察2周。

1.4.2 旷场实验 将大鼠置于旷场试验箱(50 cm×50 cm×40 cm)中央，摄录5 min行为活动，采用Xmaze动物行为分析系统分析大鼠行为变化，统计大鼠旷场运动总距离、中央区停留时间，以评估运动能力。

1.4.3 EPM实验 EPM实验前将大鼠置于60 cm×60 cm×35 cm的塑料箱中适应环境，5 min后迅速将其放于EPM中央，确保大鼠头部朝向开放臂。测试5 min，结合Xmaze动物行为分析系统，测定大鼠5 min内行为指标以及评估焦虑状态，包括进入开放臂时间(OT)、进入开放臂次数(OE)、进入封闭臂时间(CT)、进入封闭臂次数(CE)。计算开放臂进入次数比例(OE%)、开放臂停留时间比例(OT%)；OE%=OE/(OE+CE)×100%，OT%=OT/(OT+CT)×100%[6]。

1.4.4 酶联免疫吸附实验 行为学检测结束后，对大鼠断头处死并取血，以12 000 r/min速率离心5 min，取上清于-80 ℃保存备测。2 h内采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清NE、5-HT及BDNF水平。操作严格遵循试剂盒说明进行。

2 结 果

2.1 4组大鼠旷场实验结果比较 模型组旷场运动总距离长于空白组，中央区停留时间短于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)。而相比四逆散组，中药联合组旷场运动总距离缩短，中央区停留时间延长(P<0.05)，且与空白组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 4组大鼠旷场实验结果比较(±s)

与模型组比较，1)P<0.05；与四逆散组比较，2)P<0.05

2.2 4组大鼠EPM实验结果比较 模型组大鼠OE%、OT%均低于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)。中药联合组大鼠OE%、OT%均高于四逆散组(P<0.05)，而与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 4组大鼠EPM实验结果比较(±s)

与模型组比较，1)P<0.05；与四逆散组比较，2)P<0.05

2.3 4组大鼠血清NE、5-HT、BDNF水平比较 模型组大鼠血清NE、5-HT水平高于空白组，BDNF水平低于空白组，差异均有统计学意义(P<0.05)。中药联合组血清NE、5-HT水平低于四逆散组(P<0.05)，BDNF水平高于四逆散组(P<0.05)，而与空白组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表3 4组大鼠血清NE、5-HT、BDNF水平比较(±s)

与模型组比较，1)P<0.05；与四逆散组比较，2)P<0.05

3 讨 论

焦虑症类属中医学“情志病”范畴，主要症状散见于古医籍“郁证”“惊悸”“脏躁”等病症中。《素问》载：“惊则心无所倚，神无所归，虑无所定，故气乱矣。”且道：“时惊……是肾不足也。”《医碥》云：“郁而不舒，则皆肝木之病矣。”指出了该病症状及有关病机。中医学认为，焦虑症病机主要在于肝失疏泄，气郁化火生痰，扰心耗气，引发气郁及交感神经症状(惊悸等)；或七情过极，脏腑功能失调，气血失和，诱发躁动、坐卧不安等症。故治疗应以疏肝解郁、理气调血为原则[7-8]。四逆散源自《伤寒论》，组方中白芍平肝养血，柴胡疏肝解郁，枳实破气消积，炙甘草滋阴阳并调和诸药。全方共奏平肝解郁、调气养血之功[9]。现代药理研究表明，白芍、柴胡具有镇静、护肝作用；枳实可抗疲劳、耐缺氧，具有中枢抑制作用；炙甘草对躁狂抑郁性精神病、焦虑性神经症具有改善作用[10-11]。白香丹胶囊由白芍、丹皮、香附的有效成分(芍药苷、丹皮酚和α-香附酮)配伍组成。丹皮清热活血，香附引气解郁。且现代药理研究证实，芍药苷、丹皮酚不仅可镇静、抗惊厥，还能促进海马神经元存活、生长；丹皮酚亦可抑制小鼠扭体反应、运动亢进，调节中枢神经；α-香附酮则善调气血、疏肝强心[12-13]。有关研究表明，白香丹胶囊可缓解焦虑大鼠情绪，增加大鼠体重及糖水偏好系数[14]。

本研究通过足底电击法诱导大鼠焦虑样行为，采用旷场实验、EPM实验评估药物抗焦虑作用。其中旷场实验中运动总距离、中央区停留时间反映大鼠兴奋度；EPM实验利用大鼠对新环境的探究特征及对敞开臂的惊恐心理，构成矛盾冲突，以OE%、OT%反映大鼠焦虑状态。研究结果显示，模型组旷场运动总距离长于空白组，中央区停留时间短于空白组，OE%、OT%均低于空白组，表明焦虑大鼠造模成功；而相比模型组，中药联合组、四逆散组旷场运动总距离缩短，中央区停留时间延长，OE%、OT%水平亦增高；中药联合组相比四逆散组上述指标比较差异有统计学意义，但与空白组比较差异均无统计学意义。提示白香丹胶囊联合四逆散、单用四逆散均具有抗焦虑作用，且中药联合效果优于四逆散单用治疗。经分析与组方功效有关外，可能还与以下因素有关：白香丹胶囊组分对中枢神经系统存在不同调节作用，配伍四逆散可发挥多靶点、多途径、多环节协同调衡效用，进而提高疗效。白香丹胶囊中丹皮酚在抗焦虑药物制备中应用效果显著，芍药苷具有显著神经保护、抗焦虑作用[15-16]。因而中药联合用药效果更显著。

目前认为，焦虑障碍的发生与神经因子、神经递质等作用有关。BDNF是脑内促神经生长的活性蛋白质，被作为神经元功能调控因子，亦是应激所致海马神经元损伤的重要机制。Gawali等[17]研究表明，慢性应激可促使BDNF表达降低，而抗焦虑治疗后BDNF表达升高，焦虑状态改善。另有资料显示，焦虑模型大鼠血清BDNF水平相比空白组大鼠降低，BDNF与5-HT关系密切[18]。5-HT、NE神经递质失调被认为与焦虑症发病机制有关。有研究发现，血清5-HT、NE在焦虑大鼠中表达水平升高[19]。ELISA 实验结果表明，药物干预可促使焦虑大鼠血清5-HT、NE水平降低[20]。本研究显示，模型组大鼠血清NE、5-HT水平高于空白组，BDNF低于空白组；相比模型组，中药联合组、四逆散组血清NE、5-HT水平降低，BDNF水平升高，且中药联合组与四逆散组比较差异有统计学意义。提示中药联合干预对焦虑症大鼠NE、5-HT、BDNF表达调节优于四逆散单用治疗。四逆散中白芍可改善慢性应激状态下BDNF表达，调节神经递质水平；而白香丹胶囊中丹皮酚可促海马神经元生长，配伍芍药苷可增强中枢神经及神经递质调节作用。

综上所述，白香丹胶囊配伍四逆散治疗焦虑大鼠具有显著效果，其机制与上调BDNF表达及下调NE、5-HT水平有关。而对于具体成分的具体作用途径仍有待进一步研究明确。